外泌体(exosomes)是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡,具有脂质双层膜,直径大约30~150nm。在大多数活细胞中通过细胞吞吐作用主动分泌,存在于体液中,如血浆、尿液、血清、唾液和脑脊液 (CSF)等。
外泌体含有脂质双分子膜结构,携带典型的跨膜蛋白和受体、粘附分子、脂筏相关蛋白、免疫调节分子。在外泌体腔内,可以发现多种蛋白质和核酸,根据不同的细胞类型而不同。
作为细胞间通讯的关键信使,外泌体将生物活性分子传递给受体细胞,从而参与多种病理生理过程,包括肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病等。
外泌体结构[1]
图片来源于参考文献Fujita Y... 2015【1】
近年来随着科技的发展以及研究人员的实验发现,外泌体可用于早期癌症检测、愈后和指导治疗。同时,由于外泌体兼顾纳米粒子的天然性与结构的稳定性,故将其作为载体进行靶向药物的开发也具有一定的价值。
外泌体的使用需要把外泌体与其他不同的细胞外囊泡群体区分开来,如微囊泡(从质膜脱落,也被称为外泌体或脱落囊泡)和凋亡小体等。近年来随着科技的发展,分离外泌体有许多种方法,每种方法都有自己的优点和局限性。
以下是常见的分离方式
免疫分离法:通过抗体特异性结合外泌体表面蛋白标志物实现分离的方法,优点是纯度高,特异性高,分离不影响外泌体形态,适用于外泌体蛋白质的定性和定量,缺点很明显,无法进行大规模样品生产,可能需要预富集,收率低。
超速离心法:顾名思义,利用超速离心机进行分离,根据颗粒大小,密度等差异进行分离,优点是回收率高,缺点是需要使用超速离心机,成本高,超速离心可能会造成外泌体损伤,另外使用离心机比较耗时,无法大规模生产,从粘稠的样本中分离纯度较低。
聚合物沉淀法:通过使用聚合物(如PEG等)竞争性结合游离水分子,使外泌体析出,再通过离心进行回收,优点是对外泌体损伤小,使用中性pH即可,操作简单,收率高,缺点是纯度较低,杂质高,离心操作无法放大生产,成本较高,耗时较长。
超滤膜法:使用超滤的方式进行分离,优点在于步骤简单快捷,缺点是回收率低,外泌体可能会黏附在超滤膜上,产生损失收率降低,另外外泌体对剪切力比较敏感,压力和剪切力的控制不稳定可能会造成外泌体产生形变,破坏外泌体的效果。
色谱法:根据外泌体的颗粒大小使用填料进行分离的方法,优点在于分离的外泌体纯度高,收率高,工艺可放大,可重现。现在越来越多的科研人员选择使用填料来进行分离纯化外泌体,得到高纯度的样品。
百林科在外泌体纯化上可提供整体解决方案,上游的细胞发酵培养小规模培养可使用CytoLinX WB® 一次性波浪式生物反应器进行培养,大规模生产可使用CytoLinX BR® 一次性罐体式生物反应器进行培养,满足不同规模生产需求。
CytoLinX® WB 一次性波浪式生物反应器
软件界面友好且控制稳定,符合 21 CFR Part 11 要求
可选的 pH, DO ,灌流模块
使用气体质量流量计 (MFC) 对气体进行精准计量
耗材款式多样,包括基础款,pH & DO 电极款,灌流款
耗材设计囊括了细胞治疗体系
CytoLinX BR® 一次性罐体式生物反应器
硬件灵活性,稳健性:
PCS 7 自控方案的灵活性,并符合 ISA 88批量控制系统的设计和规范,批次功能的实现;可实现整厂批次控制;
支持一个控制器可热插拔,与多台反应器连接;不仅仅只可控制百林科罐体;
设备控制的稳定性,温度,pH,DO 的联动效果好。
耗材安全性,选择多样:
微泡、中泡、大泡均有,供不同工艺选择;
进口气体滤器保证袋体完整性。
下游纯化方案可根据工艺选择不同的路线,百林科的多模式在外泌体中有更好的表现及应用。
百林科MaXtar® COLL系列多模式填料双层结构组成,外壳是多孔的钝化层,核心是偶联了同时具有疏水和吸附负电荷作用基团的球形内核,最大程度结合宿主蛋白、核酸等杂质。MaXtar® COLL系列包括:MaXtar® COLL 400(确保 400KD 以上的大分子不会进孔,直接走外水流穿),MaXtar® COLL 700(确保 700KD 以上的大分子不会进孔,直接走外水流穿)。
MaXtar® COLL双层结构
相比于传统的单一模式层析介质MaXtar® COLL系列表现出更优的性能:
特的双层结构设计,以流穿模式处理大分子,工艺优化更容易,更方便线性放大。
改良的 、MaXtar® 基架具有更强刚性,因此在较低的反压下能够实现更高工艺流速,提高工艺效率。
相比于传统的凝胶过滤层析,拥有更大的上样量,降低成本。
百林科MaXtar® COLL系列多模式层析填料在外泌体分离上也有很好的表现,在客户的测试中根据收集后的样品检测结果可判断,在此项目上可实现分离目标,可进行国产替代,后续的优化条件在继续进行中。
COLL700,流穿模式(蓝色)
COLL400,流穿模式(橙色)
除此之外,中空纤维也越来越多的被应用,可以用于上游的澄清收获,也可以用于下游的分离纯化,根据实现的目的不同选择不同孔径的中空纤维来得到纯度更高的产品。百林科提供的百林科提供的TFFNOVA® 中空纤维滤器在疫苗行业有着广泛的应用,在外泌体行业中,根据最后的目的不同也可以使用中空纤维进行纯化或收集。
百林科中空纤维及配套操作系统
百林科提供的TFFNOVA® 中空纤维滤器是在 ISO 9001:2015 质量管理体系下研发和制造的,每支滤器均经严格的质量检验,持质量保证书出厂。
生物相容性:所有的流路材料均符合 USP <88> Class VI 生物相容性标准; 微生物限度:< 1000 CFU/unit; 细菌内毒素:< 0.25 EU/ml; 无动物来源:滤器所用原材料均不含有任何动物源成分或衍生物质; 运输及包装验证:符合ISTA 3A(2008)要求。 外泌体作为新兴的一类药物,也被应用在临床研究上,小的用于研究的样品,可以使用不同方法得到,但未来的商业化或者临床II,III样品的生产就需要稳定的工艺以及符合法规的生产流程来实现,纯化方法也将越来越多的被应用在行业中。
文章封面图片来源于站酷海洛
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