重组大肠杆菌表达载体的构建与培养条件的优化策略

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前言

大肠杆菌表达蛋白

（来源于：Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21(DE3). BioTechniques 29, 1234–1238）

在这个后基因组时代，蛋白质的表达和纯化在生物化学中起着核心作用。重组蛋白可以通过原核系统(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、真核系统(酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)或体外系统进行表达。大肠杆菌系统是初始筛选重组蛋白表达的首选宿主，因为它易于操作，培养成本低，生长迅速。近年来，许多新的菌株、载体和标签被开发出来，以克服该系统的局限性，包括密码子偏好性、包涵体形成、毒性、蛋白质失活、mRNA不稳定和缺乏翻译后修饰。本期我们将重点介绍大肠杆菌表达系统中表达载体的构建和培养条件的优化策略。

表达载体的构建

完整的表达载体，其基本构成主要包括复制起点、选择性筛选标记、启动子、插入的目的基因片段以及转录终止子。性能好的表达载体一般具有以下特点：拷贝数高、应用范围广、在宿主细胞中稳定性好。

目的基因的获取

1、逆转录后，从cDNA文库中获得

2、PCR从基因组DNA中获

3、基于阵列的寡核苷酸组装技术，合成定制基因

其中，基因合成的主要优点是研究人员可以自由地设计感兴趣的基因，而不受使用天然模板的限制。此外，使用密码子优化的基因可以确保可靠的表达，提高蛋白质产量和蛋白质溶解度。

启动子的选择

在大肠杆菌中表达外源蛋白的有效启动子具有四个关键特征：

1、启动子足够强

2、最小的基础转录活性

3、诱导方式简单

4、活性可以精确调节

在大肠杆菌中T7启动子具有很强的活性，重组蛋白可累积到细胞总蛋白的 50%，pET表达系统是目前应用最广泛的异源表达系统。

5'UTR和n端密码子

蛋白质的表达是通过核糖体与5'UTR中的Shine Dalgarno (SD)序列结合而启动的。SD序列与起始密码子之间的间距对翻译效率和蛋白质产量有显著影响。

融合标签的筛选

1、容易检测蛋白质表达

2、高蛋白表达和溶解度

3、容易从大肠杆菌中分离出高纯度的蛋白质。目前已经开发出了种类繁多的标签，常用标签的一般特征列于下表。

大肠杆菌宿主菌株

选择合适的宿主对蛋白的表达、溶解度和产量起着重要作用。到目前为止，已经有多种大肠杆菌菌株被改造成能显著提高膜蛋白的产量。下表总结了常用大肠杆菌宿主及其特点。

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大肠杆菌的培养

大肠杆菌培养工艺的优化策略

1、培养基组成；2、培养条件优化；3、代谢产物控制。

培养基主要成分

碳源、氮源、水、无机盐、微量元素。其中各组分的浓度和比例不同，会极大的影响重组菌株的生长和外源基因的表达。其中碳源与氮源的比例极为重要，控制碳/氮比可以调控菌体生长与蛋白表达，提高转化率，降低成本。常用的大肠杆菌培养基有LB、TB、SB、MBL等。通常，碳氮源以及各种金属离子的抑菌浓度为 Glucose 50 g/L、NH₃3g/L、Mg²⁺8.7g/L、PO₄^3-10g/L、Zn²⁺0.038g/L、Fe²⁺1.15g/L。

培养条件

pH、温度、溶氧、补料速率。pH和温度会影响菌体内各种酶的活性，从而影响其代谢产物的合成，影响目标蛋白的合成。溶氧水平也是影响转化率的重要因素，过高和过低都不利于发酵。补料速率与转化率息息相关，合适的补料速率是提高转化率、降低生产成本的关键。

代谢产物控制

乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。比生长速率越高，乙酸产生越多，可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率，从而抑制乙酸产生。葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，将其控制在一个较低的水平上，可减少乙酸的产生。

百林科苏州应用中心

蛋白表达与纯化

蛋白表达（大肠杆菌）、纯化基本流程

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