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纯化小技巧 | 生物制药工艺中,如何为不同层析介质“量身定制”保存溶液


层析介质保存所选用的溶液,最主要的作用是抑制微生物的生长。尤其在介质使用后,可能会残留蛋白质等有机物成分,微生物生长的风险相比未经使用的新介质会显著增加。介质使用后CIP及消毒阶段的有效清洗与保存溶液的抑菌能力,对生物制药工艺中的生物负荷控制同样重要。

层析介质保存溶液的选择原则

并非抑菌效果越强的溶液越适合作为层析介质的保存溶液,生物制药工艺中选择保存溶液还需要考虑:层析介质的化学稳定性、保存溶液残留的风险、保存溶液安全性、设备容器的耐受性、保存溶液成本等方面。


常见层析介质保存溶液及特性

最常见的层析介质保存溶液是20%乙醇,该溶液与几乎所有层析介质都有良好的相容性,不会影响介质的稳定性。抑菌效果明显且容易去除、经过简单的换液即可将20%乙醇溶液降低至可接受的范围。因此是应用最为广泛,也是百林科层析介质发货默认的保存溶液。


对20%乙醇保存最大的担忧来自于其安全性,乙醇是一种爆炸极限较低的有机试剂,百林科作为满足化工行业安全要求的介质生产企业可以安全广泛地使用,但对于生物制药的大部分企业,乙醇带来的防爆问题限制了生产中其作为介质保存溶液的应用。2%苯甲醇溶液是20 %乙醇的良好替代,不带来防爆问题的同时,具备良好的抑菌能力和介质兼容性,也容易通过换液方式有效去除。

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表1.百林科某层析介质在40±2℃,20%乙醇中保存稳定性数据


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图1. 百林科某层析介质20%乙醇及2%苯甲醇保存溶液去除研究


2%苯甲醇溶液已经广泛应用在蛋白A亲和等介质的保存中,在离子疏水等层析介质中应用较少的主要原因是成本。与之相比,NaOH溶液是一种更加廉价高效的保存溶液,10mM NaOH溶液即可有效抑制微生物生长。


蛋白A等亲和介质在长期接触碱时,配基稳定性会受到影响,进而产生载量的降低和寿命的缩短。离子和疏水等类型的介质,配基是简单的化学基团,对碱有良好的耐受性,适合选择NaOH作为保存溶液。百林科已进行了NaOH保存的介质稳定性研究,为用户提供保存的数据支持。

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表2. 百林科某层析介质0.1M NaOH保存稳定性研究数据


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表3. 百林科某层析介质0.01M NaOH保存稳定性研究数据


特殊介质的保存注意事项

除了亲和介质对碱的耐受性会影响保存溶液的选择之外,以阳离子为主的一类介质,也是因为稳定性的原因采用了略显不同的保存溶液。这一类介质除了使用20%乙醇抑菌之外,额外添加了不同浓度的乙酸钠,有许多用户曾咨询是否可以不添加乙酸钠仅用20%乙醇进行保存。


琼脂糖在低pH下会有分解的趋势,一般琼脂糖介质的pH稳定范围都是2以上,在pH降低至2时,上清中能检测到明显的总有机碳(TOC)升高。阳离子介质使用带有负电荷的磺酸基团或者羧基基团作为配基,仅使用水或20%乙醇保存介质时,由于要保持电荷中性,靠近琼脂糖的基团位置会聚集大量的氢离子,造成局部的低pH环境,从而影响介质的稳定性。


加入乙酸钠可以有效缓冲局部酸性环境,对于阳离子介质、配基带有负电荷的肝素(Heparin)亲和、病毒亲和(MaXtar VirsCap)等介质,都是必需的。采用NaOH作为保存溶液,同样可以避免局部过酸的情况,因此可以单独使用NaOH溶液保存此类介质,无需额外添加乙酸钠。


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图2. 百林科某琼脂糖介质pH稳定研究数据


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图3. 阳离子类介质局部过酸原理示意图


保存溶液的使用补充要点

目前,工业规模介质保存,大都选择上述溶液,实验室尤其分析常用的叠氮化钠等保存溶液,由于其残留可能造成的影响,基本不会在生物制药工艺中出现。


还需要注意的一点是保存溶液的失效,乙醇和苯甲醇长期保存会发生挥发,浓度降低后抑菌效果会大大降低;NaOH溶液则会与空气中的CO₂ 反应,浓度降低后也无法有效抑制微生物生长。因此选择保存溶液后也需要进行保存的验证,确定保存溶液更换周期。



总之,选择层析介质的保存溶液需要考虑多方面的因素,百林科为支持层析介质的保存提供全面的数据支持。


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