细胞培养过程中抗体关键质量介绍及控制专题二

一次性生物工艺banner.png

随着抗体及ADC药物领域的快速发展，动物细胞培养工艺也在不断的更新和优化。单抗类药物的活性除了由氨基酸顺序决定外，翻译后修饰亦对活性有重大影响。常见的翻译后修饰包括脱酰胺、二硫键形成、末端赖氨酸剪切、糖基化等。其中糖基化主要发生于内质网和高尔基体，是一种复杂的翻译后修饰^[1]。根据单克隆抗体的作用机制，其糖基化的位点、糖型种类及丰度都可能影响产品的有效性、安全性和质量稳定性，因此糖基化被普遍认为是单抗药物的关键质量属性（CQA）之一^[2]。

糖基化的分类

蛋白质糖基化修饰主要有N-糖基化修饰和O-糖基化修饰两种。N-糖基化修饰发生在蛋白质一级结构中的特征性序列NXT/S(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)；O-糖可以与任何含有一OH基团的氨基酸连接，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)是最常见的修饰位点。对于N-糖，当开始形成的蛋白质进入内质网，GIc3Man9GlcNAc2 糖单元会转移到天冬酰胺的侧链氨基上，随后糖基在内质网和高尔基体内进行加工，形成三种主要的N-糖型：高甘露糖型、复杂型和杂合型。

O-糖的生物合成发生在蛋白质 N-糖基化修饰、折叠和聚合后，有一系列的单糖结构，最常见的是N-乙酰半乳糖胺(GalNAC)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、木糖、甘露糖和海藻糖，从核心半乳糖胺延伸出黏液素类似的O-糖结构。

糖基化修饰过程中，并不是所有的N-糖修饰特征序列或者丝氨酸/苏氨酸一定会发生修饰，这就造成了糖基化修饰的点不均一性；另一方面，由于在生物合成过程中不同酶参与竞争，无论是N-糖修饰还是O-糖修饰，通常每个糖基化位点都会有不同的糖型结构（微不均一性）。

鉴于N-糖基化修饰在生物治疗药物的稳定性、功能及结构完整性方面的重要影响，本章主要涉及N-糖基化的内容，尤其是单克隆抗体的N-糖基化修饰。

微信图片_20240719133958.png

图一 N-糖和O-糖结构

N-糖的合成

启动N-连接聚糖合成的供体是一种Glc3Man9GlcNAc2结构，通过焦磷酸键与脂质萜醇结合。多萜醇以螺旋或折叠式构象插人脂双分子层中。多萜醇头部基团上的聚糖的组装分为两个阶段。第一阶段发生在内质网膜的细胞质侧面，第二阶段发生在腔内。

催化2个GlcNAc残基和5个甘露糖残基结合所需的酶，直接利用了核苷酸供体尿苷二磷酸UDP-GlcNAc和GDP-Man。此时，脂连接的聚糖进行跨膜易位。增长的聚糖链暴露在内质网膜的腔内侧，新糖继续添加，作为添加最后4个甘露糖残基和3个葡萄糖残基的中间供体是连接多萜醇的糖。与多萜醇连接的这两种糖，是由多萜醇磷酸与 UDP-Glc或GDP-Man反应，在内质网膜的细胞质表面上合成的。在寡糖转移酶(oligosaccharyl transferase)的作用下，寡糖由多萜醇转移至新生蛋白质的N-糖基化位点即天冬酰胺残基上，此过程伴随着蛋白质的正确折叠。

此后在蛋白质从内质网向高尔基体转移的过程中，一系列特异性的酶负责将糖链末端的一部分单糖切除，包括α葡萄糖酶I(α-glucosidaseI)、α甘露糖酶I/Ⅶ(α-MANI/Ⅱ)等，另外一系列特异性的酶负责将UDP或CMP化的单糖加人至糖链，包括N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I/IⅢ(GnT I/I/Ⅲ)、岩藻糖转移酶(fucosyl transferase)、半乳糖转移酶(glactosyl transferase)、唾液酸转移酶(sialyltransferase)等，在糖合成的不同阶段，蛋白质会离开高尔基体，从而形成蛋白质的不同N-糖型，导致蛋白质N-糖的高度异质化。

图二 N-糖型的生物合成路径

了解N-糖的生物合成路径，对理解N-糖作为治疗性蛋白制品质量属性的原因具有重要意义，并且有助于理解改造表达细胞从而改变治疗性蛋白的生物学特性。表达细胞的不同生长状态和生产工艺使治疗性蛋白产生不同类型糖型的组合，即不同的糖谱。所以糖谱在一定程度上可作为生产工艺稳定性的敏感指标，生产厂家应该对N-糖进行检测。

N-糖在寡糖转移酶的作用下只能从多萜醇转移至蛋白质的天冬酰胺残基上，罗氏公司为去除Atezolizumab可能的Fc段效应而去除N-糖(单抗Fc上的N-糖对其Fc段效应的发挥不可或缺，详见本章第二节)，采取的策略是将Fc段上糖基化位点处的天冬酰胺突变为别的氨基酸。

另外，为增强单抗的ADCC效应，可敲除表达细胞内的岩藻糖转移酶或者过表达N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ，从而消除或降低糖型中核心岩藻糖的含量。还可在培养基中加入一定量的镁离子或者丁酸盐，以增加单抗末端半乳糖的含量，从而增强其CDC功能。

N-糖的命名

N-糖的复杂性意味着对其结构的描述具有一定难度，准确描述N-糖包括三个方面：不同的单糖类型、单糖之间的连接位置及连接构象。

最准确的描述由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC，International Union of Pure and Applied Chemistry)提出并标准化，其单糖类型、连接构象和位置均由文字描述，其优点是描述准确，缺点为书写和理解较为困难。

IUPAC对单抗中常见糖型G2FS1的表述，分为一种线性和三种二维描述，其中二维描述又包括完整型、改良型和简化型三种。后又出现CFG(Consortium for Functional Glycomics)和Oxford 两种表述法，以简化N-糖型的描述，分别由功能糖组学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the Consortium for Functional Glycomics)和牛津大学糖生物学系(Oxford Glycobiology Institute)提出，现已广泛应用于糖科学家之间的学术交流。

CFG对于常见糖型G2FS1的描述，其中不同单糖由带有不同颜色的不同形状描述，连接构象和连接位置则由文字描述，较IUPAC法更为直观。由于人体内蛋白N-糖上单糖之间的连接方式和位置相对比较固定，有时会省略对二者的描述，这种描述是我们在描述治疗性蛋白制品N-糖类型中的常见形式。

Oxford对于常见糖型 G2FS1 的描述，其中不同单糖由不同几何形状描述，连接构象中实线为β、虚线为α连接位置则由几何形状的不同方位表述，此种方法更为简易、直观，并且准确地描述了不同糖型。

另外，对于单克隆抗体，由于绝大部分N-糖修饰只发生在重链大概297位的天冬酰胺残基上，此残基位于CH结构域内，其糖型相对简单，且绝大部分采用CHO、 SP2/0和NS0等哺乳动物细胞表达，连接构象和连接位置较为固定，可采用简化的文字描述形式进行表述。表7-1对简化描述形式和Oxford文字描述形式，以及CFG结构式进行了对应性的联系。

N-糖质量控制的意义

2006年，健赞(Genzyme)公司向美国FDA申请了药物阿葡糖苷酶a(alglucosidase alfa)的上市申请，以替代疗法治疗罕见遗传病庞培氏病(Pompe's disease)并获批。其商品名为Myozyme。

为满足日益增长的患者需求，健赞公司同年进行了从160 L到2000 L的生产工艺规模放大，虽然小规模临床实验数据证明二者疗效并无差别，但是美国FDA认为放大规模后与之前的产品N-糖型具有不可忽略的差异，坚持让公司重新进行生物制品上市申请。直至2008年，美国FDA才批准放大工艺后的产品上市，但是不能应用以前的商品名，新产品被命名为Lumizyme。由此可见N-糖型的控制对生物治疗产品的重要性。

N-糖可影响重组蛋白的药效。促红细胞生成素具有三个N-糖和一个O-糖，糖非还原末端的唾液酸与其体内半衰期密切相关。促红细胞生成素突变5个氨基酸位点从而引人2个额外的N-糖后(darbepoetinalfa)，其体内的半衰期明显增加；组织型纤溶酶原激活物(T-PA)其krisglel和EGF结构域上N-糖含有一定量的高甘露糖型，从而增加其体内清除率，对其进行突变后，半衰期增加。半衰期的增加可以降低给药剂量或者减少给药频率。

单抗Fc段N-糖岩藻糖的含量与其ADCC活性密切相关，每增长1%无岩藻糖抗体的含量，其ADCC活性可增加百分之几十。N-糖型可影响重组蛋白的免疫原性。西妥昔单抗由小鼠SP2/0细胞表达，其N-糖末端具有α-半乳糖，注射人体后与人体内预存的抗α半乳糖抗体结合，从而引发强烈的过敏反应，因此对重组蛋白上的非人源的单糖应予以重视。

生产工艺可对重组蛋白的糖型具有重要影响。培养基中镁离子及丁酸根的增加可增加单抗G1F和G2F糖型的含量，从而对其CDC功能产生影响。生产工艺的稳定性对工艺变更前后的质量相似性具有重要意义，如上文所示的阿葡糖苷酶a实例。

另外，对于生物类似药的研发，通常要对多批次的原研药进行详细的质量研究，尤其是糖型，然后对生产工艺进行开发，以生产出与原研药糖型具有可比性的生物类似药。

百林科CytoLinX^® BR一次性罐体式生物反应器