多糖结合疫苗的纯化

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多糖结合疫苗是一类将多糖与蛋白质载体结合起来预防性疫苗。单纯的荚膜多糖疫苗不能诱导产生免疫记忆抗体，但将多糖与载体蛋白结合后可诱导产生记忆性抗体，有效提高疫苗的免疫原性。尤其是对于2岁以下的婴幼儿，因为他们的免疫系统尚未完全成熟，对多糖疫苗的反应较弱。此类疫苗主要用于预防由具有多糖荚膜的细菌引起的疾病，如b型流感嗜血杆菌（Hib）、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌等。结合疫苗的多糖部分通常来自病原体的多糖，具有高度的种属特异性，载体蛋白部分通常选择具有强免疫原性的蛋白质，如破伤风类毒素、白喉类毒素或其突变体CRM197等。

以肺炎多糖结合疫苗为例，肺炎链球菌是人类致病率及死亡率极高的致病菌之一，严重威胁人类的生命健康。它是一类革兰染色阳性致病菌，首次分离于1881年。肺炎链球菌表面黏液层化学成分为多糖的荚膜，是肺炎链球菌主要的致病物质，具有抗原性，根据其结构特异性可将肺炎链球菌分为90多个血清型，其中10种最常见的血清型（1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F）导致了全球62%相关的侵袭性疾病。2000年由辉瑞公司研制的Prevenar成为首个上市的7价肺炎结合疫苗，由7种血清型的荚膜多糖（血清型 4、6B、9V、14、18C、19F、23F）与白喉类毒素突变体 CRM197 共价结合制成。目前，多糖结合疫苗，特别是13价肺炎球菌多糖结合疫苗（PCV13），在中国市场上已有几款产品成功上市，打破了进口疫苗的垄断地位。

肺炎结合疫苗的结合方法

「直接结合法」

直接结合法是利用肺炎链球菌荚膜多糖表面固有的官能团与蛋白载体表面的官能团进行共价偶联，多糖表面丰富的官能团为与蛋白的直接结合提供了便利。还原胺化法是典型的直接结合法，肺炎链球菌荚膜多糖表面的邻位羟基经水解或强氧化剂（如高碘酸钠）氧化后形成末端醛基，可与蛋白表面的氨基形成席夫碱结构，在还原剂（如氰基硼氢化钠）存在下转化为较为稳定的C-N 结构结合物。

「间接结合法」

间接结合法是利用链接剂将肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白进行共价结合的方法，该方法可降低空间屏蔽作用，从而影响结合物的免疫原性。目前，比较常用的连接剂是己二酰肼，两端的-NH2 可在碳二亚胺存在时分别与多糖上的氰酸酯基（表面羟基经溴化氰或CDAP活化后获得）和载体蛋白的羧基反应键合。

多糖结合疫苗纯化工艺

肺炎多糖结合疫苗工艺流程

「多糖纯化」

将收获的上游发酵液，进行超速离心或进行深层过滤，除去大的菌体碎片与可溶性杂质。随后采用超滤与MMA/IEX层析处理，进行换液与浓缩并除去HCD与HCP，最终完成多糖的制备。

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「结合纯化」

将多糖进行水解、活化、衍生、超滤后与蛋白载体通过直接或间接法结合。多糖与蛋白稳定结合后，再经过超滤与SEC/CHT层析工艺最终完成肺炎多糖结合疫苗的下游纯化。

结合疫苗不论在多糖纯化阶段还是结合后纯化阶段都要大量采用超滤工艺进行换液与除杂，以期除去HCD与HCP亦或是游离的多糖及蛋白，以及活化与结合时引入的氧化剂或还原剂。百林科FiltraLinX^® 桌面手动盒式膜超滤系统可对超滤工艺全流程监控，实现0.1-2.5m2不同过滤面积需求，是实验室小试，中试，及部分品种GMP阶段的理想选择。

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