常见VLPs疫苗的工艺路线介绍

为满足VLPs疫苗的商品化生产，工艺的可重复性、成本、产能和安全性，表达系统在VLPs疫苗生产过程中就显得非常重要，不同的表达系统可能影响VLPs的生产效率和质量。目前，已开发出几种用于VLPs疫苗生产的表达系统，包括细菌（如大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物、哺乳动物细胞和无细胞表达系统。生产放大中，常用的为大肠杆菌和酵母两种表达体系。其中，大肠杆菌表达平台成本低、产量高，适用于简单VLPs的生产，在修饰方面稍显不足。酵母表达系统则生长迅速、成本低廉，能提供一定程度的翻译后修饰，适用于大规模生产。目前已报导的VLPs疫苗约70％基于真核表达系统，30％基于原核表达系统。

对于几种已经获批的VLPs疫苗，HBsAg VLPs采用了酵母或CHO细胞；人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV) VLPs采用酿酒酵母(Gardasil)或昆虫细胞(Cervarix)；而戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV) VLPs疫苗Hecolin采用大肠杆菌表达，并体外组装。此外，无细胞表达系统也已成功应用在VLPs的表达上。

「HBV乙型肝炎病毒疫苗」

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是乙型肝炎的主要病原，属于包膜DNA病毒，包含由脂质和三种包膜蛋白组成的外膜。目前，疫苗接种是预防HBV感染最有效的方法。

「HPV人乳头瘤病毒疫苗」

宫颈癌是全球女性癌症死亡的第二大常见原因，全世界约70%的宫颈癌由高危HPV亚型16和18导致，四价Gardasil(MSD)是第一个被批准作为人乳头瘤病毒(HPV)预防性的疫苗。在酵母中表达得到的重组蛋白L1自组装成VLPs，主要为HPV 6/11/16/18这四种HPV类型引起的病毒感染提供保护。

「HEV戊型肝炎病毒疫苗」

HEV是一种非包膜单链RNA病毒，其基因组包含3个开放阅读框，ORF2编码唯一的结构蛋白。厦门万泰生物技术有限公司研制的基于截断的pORF2的HEV239 (Hecolin)于2012年在中国获批，该疫苗由大肠杆菌表达，是全球首个且唯一的戊肝疫苗。

「动物VLPs疫苗」

口蹄疫疫苗、小反刍兽疫疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪圆环病毒疫苗（Ⅱ型）、猪细小病毒疫苗、高致病性禽流感疫苗、新城疫疫苗、裂谷热疫苗、蓝舌病毒疫苗等。

「人用VLPs疫苗」

人用VLPs疫苗，有很多有现役疫苗，是因为基于基因工程重组蛋白构建VLPs，可以完全人工设计、能对VLPs进行多种修饰满足不同需求，其免疫原性和安全性的可控程度高。例如，手足口疫苗（EV71病毒）、手足口2价疫苗（EV71病毒+CA16病毒）、呼吸道合胞病毒疫苗、诺如病毒疫苗、埃博拉疫苗、流感疫苗、基孔肯雅病毒疫苗、艾滋病疫苗、疟疾疫苗等。

一般下游工艺流程图

（图片来源：网络）

VLPs疫苗下游纯化工艺

纯化包括粗纯、中间纯化及精纯等阶段。色谱法是VLPs下游工艺的核心操作单元，包括亲和层析、离子层析、疏水层析、分子筛层析以及复合模式层析。

国内乙肝疫苗有两种表达方式，分别是CHO细胞、酵母。酵母细胞在制备HBsAg时多为胞内表达，需收获裂解后澄清，疏水捕获（HBsAg蛋白的疏水键可与疏水配基结合），流穿模式下阴离子去除大量HCP等杂质，分子筛精纯去除小分子杂质。而CHO细胞表达系统多为胞外表达，料液中含少量HCP，无需裂解过程。CHO含糖基化HBsAg，更接近天然结构，纯化过程与酵母表达系统相比简单，可在粗纯阶段选择疏水作用相对较弱的填料。

推荐百林科MaXtar^® 系列HIC，IEX填料，以高刚性琼脂糖为基架偶联相对应的疏水基团，反压低、流速快，适合生物分子的大规模分离纯化。

上市HPV疫苗源于大肠杆菌、酵母以及杆状病毒/昆虫细胞三种表达系统。

百林科MaXtar^® S HC，基架具有更强刚性，在较低反压下能够实现更高工艺流速，提高工艺效率。在保证分离效果的同时，兼具高动态载量。在捕获阶段提供更快速,更高效的分离纯化选择。后续通过羟基磷灰石(BARONHAP™) 、离子或疏水层析进行精纯。

多模式层析因为能同时提供不同类型的相互作用力，所以也多用在 VLPs 纯化工艺开发中。百林科MaXtar^® COLL 400和700是新型的多模式层析介质，分子量排阻分别为400KD和700KD，它由两层不同的结构组成。外壳是多孔的钝化层，小于对应分子量的杂质进入微球内部与配基基团结合。大于对应分子量的大分子不会进孔，直接走外水流穿；核心是偶联了同时具有疏水和电荷吸附作用基团的球形内核，最大程度结合宿主蛋白、核酸等杂质。该层析介质能很好的用于多种大分子生物样本的分离纯化，是疫苗生产中病毒纯化介质的极佳选择。

案例1—口蹄疫VLPs：、

Ni Chromstar® Excel

Ni Chromstar^® Excel在本次试验中，样品加入0.1% 吐温20和1 mM DTT，且在上样时添加20 mM 咪唑，洗脱后洗脱液纯度较高，且介质载量为4.63 mg/mL。

案例2—EV71病毒：

EV71 疫苗，三步层析分别用百林科Chromstar^® 6FF，Q Chromstar^® XL，Puredex^® G-25M 填料进行小试试验。

参考文献：

[1] Cervera L, Gòdia F, Tarrés-Freixas F, Aguila-Gurrieri C, Carrillo J, Blanco J, Gutiérrez-Granados S. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Appl Microbiol Biotechnol. 2019 Sep;103(18):7367-7384.