二氧化碳是细胞代谢的产物之一。在过去的二十多年中,为阐明中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等哺乳动物细胞系的代谢,科学家们利用同位素示踪和质谱分析的代谢流分析法(MFA)以及动态代谢流分析组合的方法研究了CHO-K1细胞不同生长阶段的物质和能量代谢水平。
CHO细胞的中心代谢途径特征及CO2在细胞代谢中的位置如图1所示。
CHO-K1细胞指数生长期(0-4天,第一天到第二天的比生长速率为0.033h-1)糖酵解(Glycolysis)和回补反应(Anaplerosis)水平较高,细胞数量快速增长。回补途径中CO2/HCO3-作为底物和丙酮酸发生羧化反应产生草酰乙酸;谷氨酰胺分解生成α-酮戊二酸;苹果酸在苹果酸酶(ME, Malic Enzyme)催化下生成丙酮酸,为三羧酸循环(TCA循环)补充中间产物。所以指数生长阶段,CO2既是反应底物也是代谢产物。
稳定期(4-6天)细胞糖酵解反应和回补反应大大减少,TCA循环水平和指数生长期一致。此阶段氧化戊糖磷酸(oxidative Pentose phosphate pathway)途径代谢流较高,是细胞产生ATP和还原性辅酶A(NADH/NADPH)的主要代谢途径,为细胞提供能量和氧化应激所需的还原力。
由于细胞密度不断增加,稳定期细胞产生大量CO2。细胞衰亡期营养都已耗尽,但细胞通过高效利用乳酸和甘氨酸补充丙酮酸,维持TCA循环水平,用于细胞代谢和产热。
综上,细胞指数生长期需要CO2/HCO3-作为反应底物,细胞稳定期和衰亡期则排出大量CO2。作为细胞代谢中重要的底物和产物,CO2是哺乳动物细胞培养工艺开发中一个备受关注的参数。
图1. CO2在CHO细胞中心代谢途径中的位置。图中黄色方框内为酶的简写:
HK,己糖激酶;PK,丙酮酸激酶;LDH,乳酸脱氢酶;
PDH,丙酮酸脱氢酶;PC,丙酮酸羧化酶;ME,苹果酸酶。
细胞培养中CO2的来源和逸出
细胞培养中pCO2是溶解在培养液中的CO2产生的压力。哺乳动物细胞培养中,CO2的来源包括细胞呼吸产生的CO2、培养基中NaHCO3的分解和控制pH加入的CO2和Na2CO3。动物细胞培养大多使用碳酸—碳酸氢盐(H2CO3—HCO3-)缓冲系统,培养基中碳酸氢盐浓度越大,相同pH下pCO2越高。37℃时,平衡体系中有:
由亨利定律可知:
结合(1)和(2)有:
CO2逸出(CO2 stripping)是溶解在培养液中的CO2从液相中脱离进入气相的过程。如图2所示,为CO2气体溶解于培养液中所发生的反应,K1、K2 为反应平衡常数,CTR(carbon dioxide mass transfer rate)为CO2传质速率,CER(carbon dioxide evolution rate)为细胞CO2产生速率,KLaCO2为CO2传质系数。
培养系统中CO2的逸出快慢用CO2逸出速率(CO2 stripping rate)表示,一般采用pH随时间的变化表示(△pH/△t)。理论上,当CO2逸出速率等于CO2生成速率时,培养系统中细胞产生的CO2可以完全逸出而不影响pCO2水平。
图3. 培养基中CO2的平衡
CO2是哺乳动物细胞中心代谢途径中的重要反应底物和代谢产物,其浓度的高低通过单独和偶联pH、HCO3-、渗透压的作用影响细胞的生长、代谢甚至蛋白产量和质量。细胞培养过程中CO2的变化一般直观的体现在pH的变化上,pH控制策略的特点通常是在设定点附近有一个宽死区,允许培养物pH值漂移而不会触发碱或CO2的添加,是控制渗透压或溶解CO2的可行的替代方案。
平衡pH值对细胞生长、乳酸合成、渗透压和溶解CO2的影响,在工艺优化过程中作为关键考虑因素。百林科生产CytoLinX® BR一次性罐体式生物反应器及CytoLinX® WB一次性波浪式生物反应器,配备pH控制单元,反应灵敏、迅速,pH变化可级联CO2、碱泵、酸泵实现对pH值的在线监控。
百林科CytoLinX® WB一次性波浪式生物反应器
产品特点:
10L,20L,50L三种托盘规格供选择,托盘及培养袋安装均无需拆拧螺丝,简单快速完成安装操作;
支持灌流功能,泵流速具有自动校准功能,实现精准补料及收获;
通气,pH/DO,灌流功能模块可根据工艺需求方便组合选配;
增加部分联动设计,更适用细胞治疗客户应用场景;
使用气体质量流量计(MFC)对气体进行精准计量。
百林科CytoLinX® BR一次性罐体式生物反应器
产品特点:
灵活性强,适配度高,更多选择让工艺开发和表征更加灵活;
设备控制的稳定性,温度,pH,DO的联动效果好;
大泡,微泡均可选择,满足多种工艺需求。
罐体形状结构良好,功能齐全,单个控制柜可通过插拔控制多台反应罐,实现成本的大幅度降低(根据工艺需求可提供不同大小反应罐体积,支持工艺放大);
采用稳定的PCS7系统,符合ISA 88控制系统,可实现全厂控制;
软件设计符合21 CFR Part 11,界面用户友好;
配置灵活,可根据用户需求进行部分定制;
设备配件均采用进口高端品牌,并经过出厂检测保证正常使用;
配套使用一次性生物反应袋底通大泡、中泡、微泡可选,满足多种工艺需求。
参考文献
刘小双,陈飞,赵孟江,洪巧巧,徐寒梅 pCO2在哺乳动物细胞培养中的影响和应用chinaXiv:201812.00135v1
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