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纯化小技巧 | Heparin 亲和填料应用指南和使用小技巧分享


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Heparin 亲和是将肝素共价偶联到琼脂糖基架上而制成的亲和层析介质肝素是一种天然存在的多糖硫酸酯,与多种生物分子具有亲和作用,也可以作为离子交换配体使用。该层析介质可用于分离纯化凝血因子、抗凝血酶 III、生长因子、干扰素、脂蛋白脂肪酶以及核酸和类固醇受体的酶等。


其主要特性包括:

  • 基于共价偶联的特性,具有较高化学稳定性,配基不易脱落。

  • 高度的选择性和亲和力,尤其对抗凝血酶 III,非特异性吸附低。

  • 广泛应用于工业领域,具备完整的法规支持文件。


肝素亲和填料主要纯化应用领域

截至目前,各类研究发现肝素与上百种蛋白具有亲和作用,因此肝素亲和填料广泛应用于血浆蛋白、病毒和病毒颗粒、DNA 结合蛋白、以及乳铁蛋白等纯化过程。


血浆蛋白

抗凝血酶 Ⅲ 的纯化应用:肝素亲和填料能够特异性地结合并分离抗凝血酶 Ⅲ,这是一种重要的血浆蛋白,具有强大的抗凝血作用。通过肝素亲和填料纯化得到的抗凝血酶 Ⅲ 可用于治疗血栓性疾病。


凝血因子的纯化应用:肝素亲和填料也可用于分离和纯化凝血因子,如人凝血因子 IX、XI 和 VIII 等,这些凝血因子在血液凝固过程中起着关键作用。


病毒及病毒样颗粒

肝素参与病原体感染过程,与多种病毒有亲和特性,因此可以用于病毒疫苗和病毒载体的纯化。基于肝素亲和层析配基的结构与硫酸肝素蛋白聚糖相似性,肝素亲和层析可用于 AAV2 型的分离纯化。此外,肝素亲和填料也用于单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、HIV-1 gag VLPs 等的纯化。


DNA 结合蛋白

在与 DNA 结合蛋白质间的相互作用中,Heparin 可以模拟核酸的多阴离子结构,与核酸结合蛋白产生特异性亲和作用。利用这一特性,进行转录因子、核酸酶等的纯化。


乳铁蛋白

在合适的工艺条件下,乳铁蛋白与肝素通过离子键发生结合作用,故肝素亲和填料也可用于纯化乳制品中的乳铁蛋白。



应用实例分享——血浆中纯化抗凝血酶 III

建议工艺条件:


  • Column:Heparin Chromstar® FF (D:1.6 cm*H:20 cm)


  • Sample:AT III


  • Buffer A:20 mM PB,0.1 M NaCl,pH 7.2


  • Buffer B:20 mM PB,2 M NaCl,pH 7.2


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小结:对肝素亲和后洗脱样品进行检测,回收率和比活均符合预期。


使用 Tips

  • 在使用肝素亲和填料过程中,为平衡亲和作用和离子交换两种作用,结合缓冲液中通常加入较低浓度的盐。既可以降低非特异性吸附,又不影响离子交换作用。而洗脱方式通常利用离子交换的特点,使用 1.5 M-2 M 的NaCl、KCl 或硫酸铵洗脱。


  • 肝素本身在低 pH 不稳定,使用时应该避免 pH<4 的条件。


  • 后处理建议使用 2 M NaCl 清洗离子结合蛋白,可以使用 6 M 盐酸胍或 8 M 尿素清洗沉淀或变性蛋白,使用非离子去污剂清洗疏水结合蛋白,避免使用离子型去污剂。



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