RNA 疫苗生产关键：质粒下游纯化工艺路线与优化策略

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mRNA是细胞内一种重要的分子，它携带从DNA转录来的遗传信息，并指导蛋白质的合成，在生物技术和医学领域，特别是疫苗开发和基因治疗中，mRNA技术有着举足轻重的作用和巨大的市场潜力。

mRNA类疫苗的制备工艺包括了质粒DNA（pDNA）模板的制备、pDNA线性化、体外转录（IVT）并纯化、mRNA的纳米脂质颗粒（LNP）包封,最后经制剂和冻干，得到mRNA类疫苗产品。在全球供应链不确定性和地缘政治风险加剧的背景下，百林科可提供成熟的上下游全流程解决方案。

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图1. mRNA完整工艺流程

质粒DNA（pDNA）纯化

质粒DNA为制备mRNA的原料，其制备工艺较为成熟，可选择经典三步法和改进两步法工艺。三步法具有操作简单、平台适用性强等优点，而两步法具有工艺时间短、易放大、成本低等优点。

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图2. 质粒纯化解决方案

经典三步法首先是裂解步骤，pDNA一般使用碱裂解步骤，此步可选择性地沉淀染色体DNA和其他大分子杂质。常用菌体重悬溶液：50mM Tris-HCl,10mM EDTA-2Na,50mM glucose, pH8.0。常用的裂解溶液：0.2M NaOH,1%SDS。常用的中和溶液：3M KAc, 5M HAc。其中菌体重悬浓度、裂解时间、中和液比例为关键工艺参数。重悬浓度过高可能会导致菌体裂解不充分，过低会增加后续步骤体积，增加成本。裂解时间过短或不合适的裂解方式可能使裂解不充分，收率偏低，时间过长可能会增加开环比例降低超螺旋质粒质量。各因素间存在相互交互作用，必要时设计DOE实验，确定最佳工艺参数。

第二步为澄清，碱裂解中和后呈蛋花状，必要时可加入一定量的碳酸氢铵或碳酸氢钠使其固液分离，再使用深层过滤或离心澄清。

第三步为UF/DF，此步目的是除去部分RNA、HCP、色素等杂质，减少体积，降低层析步骤的负荷。可选择超滤膜包和中空纤维完成浓缩和洗滤，较为脆弱的质粒可选用中空纤维，相比于超滤膜包有较低的剪切力。超滤载量、剪切力、浓缩倍数、跨膜压力为关键工艺参数。应注意避免浓缩倍数过高引发聚集，避免剪切力过大导致产品质量下降。超滤膜包/中空纤维可按图示标准选膜。UF/DF阶段可选用百林科TFFNOVA^® 系列中空纤维搭配FiltraLinX^® Pilot 超滤系统，百林科TFFNOVA^® 中空纤维膜是非对称结构，膜层致密，外层相对开放。其独特的结构设计可以使得非特异性吸附更低，过滤速率更快，通量更高，过滤时间更短，能有效的用于质粒的浓缩与换液。

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图3. 超滤膜包/中空纤维选择标准

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图4. 百林科TFFNOVA^® 系列中空纤维柱

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图5. 百林科FiltraLinX^® Pilot超滤系统

第四步质粒为质粒的层析工艺，三步法可选择百林科：Chromstar^® 6FF+MaXtar^® PlasmidCap HR+MaXtar^® Q HR。

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Chromstar^® 6FF为分子排阻层析填料，此步目的是去除RNA。在合适的盐浓度下，pDNA最大，从外水先出，RNA后出，从而实现分离。此步关键工艺参数为平衡溶液、上样载量、线性流速、柱高等。平衡一般使用2.1M (NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。高浓度硫酸铵RNA会收缩，RNA和DNA空间差异最大化，有利于DNA、RNA分离，并且直接衔接下一步嗜硫亲和。上样载量与分子大小差异有关，一般低于0.3CV，柱高一般大于30cm，流速一般低于60cm/h。该填料在某客户质粒纯化中取得了良好的分离纯化效果。

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图6. 百林科Chromstar^® 6FF纯化案例

MaXtar^® PlasmidCap HR为嗜硫亲和层析填料，由于超螺旋质粒与开环质粒分子性质高度类似，区别在于超螺旋质粒具有更高的碱基暴露程度和表面电荷，与填料结合更强，嗜硫亲和介质可高效区分这一微弱差别从而实现分离。关键工艺参数为载量、平衡洗脱Buffer等。对于序列和大小不同的质粒，需要对纯化条件进行调整。开环的去除通常有两种思路，第一种思路为在相对高浓度硫酸铵下，超螺旋与开环质粒一同结合到层析介质，通过一步合适条件的淋洗去除开环质粒，最后洗脱超螺旋质粒。第二种思路为将样品调节至合适浓度硫酸铵，使开环流穿，超螺旋质粒结合到层析介质从而达到分离目的。对于不同的质粒，纯化条件需要优化。常用的平衡溶液：2.1M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。洗脱溶液：0.3M NaCl，1.7M (NH4)2SO4 ，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。该填料在某客户质粒纯化中取得了良好的分离纯化效果，且载量可达2mg/mL。

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图7. 百林科MaXtar^® PlasmidCap HR纯化案例

MaXtar^® Q HR为阴离子交换填料，此步目的是去除内毒素等痕量杂质。关键工艺参数为载量、平衡及洗脱溶液等。常用的平衡溶液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。洗脱溶液：1 M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。在某客户案例中经过MaXtar^® Q HR 进一步纯化，载量可达2mg/mL，可有效将内毒素控制在合格范围内。

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图8. 百林科MaXtar^® Q HR纯化案例

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图9.质粒三步法纯化案例数据汇总

最后一步为UF/DF浓缩换液，除菌过滤。根据需求浓缩换液到适宜的浓度和溶液中。

常用的存储溶液有TE（Tris-EDTA）溶液、Tris-HCl溶液、PBS、WFI、无核酶水等。

TE适合长期保存质粒，EDTA抑制核酸酶活性，但会影响限制性内切酶等活性，若后续要做质粒线性化、IVT反应等可以将质粒存储在WFI中。超滤需注意载量和剪切力等工艺参数以避免超滤时间过长和剪切力过大从而影响质粒质量。

质粒经典三步法虽最为常用，但却有工艺时间长、生产成本高等缺点。因此，越来越多客户选用改进的两步法制备超螺旋质粒。百林科针对不同的质粒产品和用户需求，可提供不同的质粒产品纯化策略。两步法层析使用氯化钙沉淀RNA代替分子排阻层析去除RNA，从而节省时间及硫酸铵用量。氯化钙的浓度是关键工艺参数，不同质粒氯化钙沉淀的浓度也可能不同。需要注意的是，过高浓度的氯化钙可能会沉淀掉较多的超螺旋质粒，导致质粒收率较低；过低浓度的氯化钙浓度会使RNA沉淀不完全，导致RNA残留过多，增加层析步骤的负荷。因此，不同质粒需优化氯化钙沉淀的浓度参数。氯化钙沉淀中间品经澄清和UF/DF后，可使用MaXtar^® PlasmidCap HR+MaXtar^® Q HR/ MaXtar^® Butyl HR去除HCP、内毒素、开环质粒等杂质，也可使用百林科Coll系列复合模式填料。复合模式填料具有分子筛层析、离子交换层析及疏水层析三种层析模式质的协同作用，从而去除 HCP、RNA、内毒素等杂质。

质粒线性化阶段使用限制性内切酶将超螺旋的质粒DNA线性化，线性化质粒须除去酶切引入的酶等杂质，可选择离子交换例如MaXtar^® Q HR或MaXtar^® DEAE等。最后需要超滤完成缓冲液的置换以达到IVT反应的要求。

IVT反应后mRNA纯化工艺一般采用Oligo dT亲和层析进行捕获，可选择百林科Maxgo^® oligo dT(25) pro，去除酶类、NTP及模板DNA等工艺相关杂质，后采用高分辨的疏水或离子填料进行精细纯化，去除片段或dsRNA等产品相关杂。也可以选用复合模式层析填料（Coll系列）代替Oligo dT。有应用表明复合模式层析纯化mRNA的载量高于Oligo dT亲和层析的平均载量，并且可以有效去除消化后的pDNA、蛋白及NTP，且具有更快的工艺时间、需要更小的层析柱规格及更低成本的优点。

百林科苏州应用中心简介

百林科苏州应用中心占地面积3000sqm，设有研发办公区、细胞培养实验室、微生物实验室、纯化实验室、中试车间、分析实验室。苏州应用中心致力于为客户提供上下游工艺开发，小试及中试规模样品制备，验证及培训等服务。

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