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微载体细胞培养案例分享


什么是Puredex® Cyto-1微载体


  1. Puredex® Cyto-1 是一类基于交联葡聚糖基架,带有正电荷基团的微载体,它可以为细胞提供广阔的附着面,从而提高细胞密度,实现高产。微载体不仅为贴壁细胞改变培养方式提供了可能,更方便优化细胞培养工艺,实现降本增效。

  2. Puredex® Cyto-1 微载体可以用于多种宿主细胞的培养,包括 293 细胞、Vero 细胞、CHO 细胞等。独特的产品性能,使得 Puredex® Cyto-1 微载体成为当今要求极高的上游细胞培养工艺中不可或缺的材料,可以在抗体、疫苗、核酸、酶和重组蛋白等生物制药领域中发挥重要作用。

  3. Puredex® Cyto-1,采用生物兼容性好的交联葡聚糖基架,表现出极佳的细胞培养性能。


微载体可以培养哪些细胞


哺乳动物、禽类、鱼和昆虫细胞已经成功实现微载体培养, 它们具有广泛的组织来源,包括原代细胞,二倍体细胞株和传代/转化的细胞系。此外,杂交细胞系和肿瘤来源的细胞系也同样适用于微载体培养模式,据统计,目前可通过微载体培养的细胞种类已达 150 余种。


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表1:微载体适用范围


如何选择微载体


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表2:微载体选择参数


微载体的操作步骤


1、微载体预处理


首先,干燥的微载体在无 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸缓冲液(PBS pH=7.4,每克微载体加50-100mL)中在室温下浸泡膨胀至少3h。弃去上清液,用新配制的无 Ca2+ 、Mg2+ 的PBS(pH=7.4,每克微载体加30-50mL)洗涤微载体数分钟。接着,弃去 PBS,换上新的无 Ca2+ 、Mg2+ 的 PBS(pH=7.4,每克微载体加 30-50mL)。之后,微载体溶液用高压灭菌法灭菌(121 ℃,30min)。微载体Puredex® Cyto-1 非常稳定,可以反复进行高压灭菌而不影响其性能。灭菌结束后使用前,加入培养基润洗置换(20-50mL/g),之后加入 10%血清或无血清培养基放置平衡过夜。


微载体水化镜检图


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水化操作(关键点)


  • 均匀悬浮:在轻轻摇晃下,微载体能形成均匀的悬浊液,无肉眼可见的结团。

  • 良好沉降:静置后,能在合理时间内(10-20min)形成致密、平整的沉淀层,上清清澈。

  • 显微镜观察:在光学显微镜下,颗粒圆整、大小均一、表面光滑、无过多碎片。



2、微载体培养


准备好消化好的细胞,连同之前准备好的微载体一起加入方瓶或反应器中(微载体加量 1-5g/L),在一定条件下开始培养,2-4小时后观察细胞贴附情况。如果细胞贴附良好,继续跟踪培养,观察细胞生长情况。



3、微载体培养操作要点


  1. 培养初期:保证培养基与微球体处于稳定的 pH 与温度水平,接种细胞(对数生长期, 而非稳定期)至终体积 1/3 的培养液中,以增加细胞与微载体接触的机会。常使用 2-3g/L 的微载体含量,更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。由于动物细胞无细胞壁,对剪切力敏感,因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是:在贴壁期采用低搅拌转速,间歇式培养;数小时后,待细胞附着于微载体表面时, 维持设定的低转速,进入连续培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢,最大速度 60-70r/min。 

  2. 贴壁阶段(4-8h)后:缓慢加入培养液至工作体积,并且增加搅拌速度保证完全混合。 

  3. 培养维持期:进行细胞计数(血球计数板/细胞计数仪)、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖,微球变得越来越重,需增加搅拌速率。


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4、细胞计数方法(关键点)


离心收集


取1-2mL培养液放置离心管,离心(1000rpm,5min),弃上清,加入5 mL PBS 进行润洗,润洗后离心(1000rpm,5min),弃上清。


消化


加入 1mL含0.25%胰酶消化液(建议比例 1:1),放置细胞培养箱(37℃、5%CO2) 2-20min,2min 一次,吸出 10ul-20ul 培养液放置载玻片(镜检查看细胞消化状态),反复多次吹打,多次查看消化状态,直至微载体和细胞完全分离(预计 10-15min 完全消化), 加入等体积的培养基终止消化。


染色比例:0.2-0.4%


  1. 通用比例:1:1 50ul(培养液)+50ul(染色液),终浓度:0.2% 。

  2. 染色比例:1:4(适用于敏感细胞) 20ul(培养液)+80ul(染色液),终浓度:0.32% 。

  3. 染色时间:1-2min(微载体培养细胞更为脆弱,避免假阳性死细胞)。


取样计数


取 10-20ul 培养液(染色后)加至计数板内,使用显微镜(20x)进行镜检。每个细胞 只计数一次。调整焦距以防漏记。 重点计数区域:四角 4 个方格 边线:细胞压在左侧或上侧(计入)、细胞压在右侧或下侧(不计入)。


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工艺放大推荐


百林科CytoLinX® RW

 一次性摇摆式系统


CytoLinX® RW 一次性摇摆式系统不仅可作为种子罐使用,还可以通过球转球工艺轻松放大至一次性生物反应器,摇摆运动能有效防止密度较高的微载体在底部沉淀堆积,确保每个微载体都能充分接触营养和氧气,从而实现细胞的均匀贴附和生长,其次该摇摆系统是一种操作简便,细胞友好度较高,是注重成本控制用户的绝佳选择。

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图8:百林科CytoLinX® RW 一次性摇摆式系统


百林科CytoLinX® BR 

一次性罐体式生物反应器


为进一步实现微载体规模化培养,可以采用CytoLinX® BR 一次性罐体式生物反应器进行工艺放大,收获时,可以直接在一次性袋内进行沉降或使用内置的过滤装置。许多一次性反应袋设计有底部沉降袋或专门收获口,可以方便地将含有细胞的微载体悬液转移至收获系统,减少了多次转移带来的污染风险和细胞损失。微载体容易在传统不锈钢反应器的缝隙、搅拌轴密封处、阀门等死角残留,极难清洁,是交叉污染的重大隐患。一次性袋子内壁光滑、无死角,使用后即废弃,从根本上解决了微载体残留问题。设备提供精准的温度、pH和溶氧浓度控制,适用于大体积的生产需求,省去(CIP/SIP)复杂的清洁验证,同时具备优异的密闭性和生物安全性,适用于多种工艺要求(同一个硬件适应不同生产需求)。

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图9:百林科CytoLinX® BR 一次性罐体式生物反应器



百林科苏州应用中心简介


占地面积3000sqm,设有研发办公区、细胞培养实验室、微生物实验室、纯化实验室、中试车间、分析实验室。苏州应用中心致力于为客户提供上下游工艺开发,小试及中试规模样品制备,验证及培训等服务。

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