填料寿命验证的法规要求及设计

寿命验证实验需要完全能够反映商业化的生产工艺的性能的缩小模型上进行，缩小模型可使用工艺表征期间建立和确认的缩小模型。研究填料在特定的循环次数情况下，通过对柱效、载量、纯度、杂质含量、收率等技术指标进行数据分析，以确定填料的使用寿命为商业化的填料使用寿命提供参考。

一个典型的层析工艺涉及两个主要步骤，层析工艺操作步骤和层析工艺维护步骤。两个步骤的工艺参数都会对其所处理的产品的质量和安全性产生影响，因此，都需要在工艺验证中进行验证。

1.同步验证

➣ 在大规模上进行循环研究；

➣ 每隔 n 次运行来评估层析柱性能；

➣ n+1 运行进行空白运行；

➣ 最后的 n 个循环收获的样品进行隔离直到检测最后的运行符合所有的质量标准。

2.前瞻性验证

➣ 在缩小模型上进行循环研究； 

➣ 每隔 n 次运行来评估层析柱性能；

➣ 每隔 n+1 运行进行空白运行；

➣ 一旦在缩小规模上知道了层析填料寿命，然后在使用合适的安全系数在大规模上进行验证。

工艺验证之前需要进行完成：

➣ 通过风险分析确定产品的关键属性 CQA 和关键操作参数 CPP；

➣ 通过实验设计对工艺过程的理解，形成设计空间；

➣ 验证分析方法，校正设备。

设备确认，方法确认，缩小模型验证：

➣ 用于前瞻性使用寿命研究的设备仪器的确认；

➣ 建立和确认用于前瞻性使用寿命研究的缩小模型；

➣ 确认在缩小模型上层析柱柱效和重新装填频次；

➣ 确认在缩小模型上层析操作的关键条件；

➣ 确认在缩小模型上层析介质清洗效果；

➣ 确认前瞻性使用寿命研究的原材料控制要求；

➣ 在缩小模型上建立前瞻性使用寿命研究的检测指标。

包括动态结合载量、回收率、对产品相关杂质和工艺相关杂质的去除率，以及层析介质自身属性(如配基密度、粒径分布、压力/流速曲线等)。层析填料性能的降低直接影响终产品药物的安全性和有效性。 

• 该步骤在纯化工艺中的位置(捕获、中度纯化或者精细纯化)

• 来料性质(各种杂质的数量和种类)

• 层析模式(结合/洗脱或者流穿模式)

• 层析填料的类型(物理和化学稳定性)

• 维护(清洁、消毒和保存程序的有效性) 

• 层析柱装填和损耗(装填方法和物理稳定性)

• 系统组件(层析柱和支持组件的设计) 

• 原材料质量(原材料中杂质的性质)

• 经济性(填料成本与验证成本)

建立评估项目，确定可以接受的寿命：

1. 层析填料和层析柱相关指标：柱效(HETP 和 As)、压力/流速性质、层析填料配基密度等；

2. 层析行为相关指标：UV、pH 和电导层析图谱、层析收集液体积；

3. 产品评价相关指标：包括产品的收率、纯化、产品相关杂质以及工艺相关杂质的残留、污染物(微生物和内毒素)的残留等；

4. 空白运行：相关杂质的残留(Carryover)。

填料寿命验证时间：

在工艺确认具有大规模生产批次样品之后，临床三期的阶段。

• 重复装柱：对填料反复施压，以及装柱压力控制不当。

• 样品性质：样品澄清度、粘度、酸碱度、成分等。

• 层析工艺：柱床高度、流速及反压；不同缓冲液类型。

• 维护保养：不合理的维护保养，或者对层析柱不进行维护保养。

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➣ 准备阶段：
1.1 填料法规支持文件(RSF)、ISO9001 证书、质量保证协议、供应商评价与审计。

其中法规支持文件包括：基本介绍、质量体系、产品描述、生产过程、产品质量、产品稳定性、浸出物、毒理分析、免疫学性质等。

1.2 清洁储存方法验证

不光能对杂质进行有效去除，还不能对填料本身性能造成损伤。听从介质供应商的建议，参考 RSF 文件。

1.3 设备确认

法规明确规定，验证过程中保证设备正常。非金属材质，具有最高生物安全性；硬件设备配件材质具有完整一致性，可追踪性；设备软件必须具备防止造假功能，真实有效完整记录生产过程。

1.4 商业化生产信息

生产工艺 SOP；样品性质、稳定性；层析柱重复装填频率(这个应该在柱效验证中完成)；层析柱性能指标、柱效、对称性；层析图谱；关键质量属性、杂质、纯度；分析方法及检测频率。

➣ 建立阶段：

2.1 建立缩小模型

在小柱子上代表大规模的性能表现，进行寿命验证。保持不变(柱高、线性流速、上样量/比、缓冲液 CV、梯度体积 CV、收集标准)；缩小(直径、体积流速、样品体积)。同时，使用生产原料(所用物料、缓冲液指标、上样料液)，与生产类似层析设备与操作条件(仪器设计一致、材质、检测器等)以及温度。

2.2 评价参数

确保缩小模型能反映大规模生产的性能。主要参数：HETP、As、小规模3批与生产规模3批产品质量相关参数分析。

2.3 填料寿命评价参数

层析柱的动态结合载量、HETP、As、压力等；层析洗脱峰图谱、pH 图谱、电导图谱等；产品的收率、纯度、杂质去除效果等；Carry over，符合规定标准。

➣运作阶段：

3.1 预期循环次数

预期填料循环 N 次数，并确定循环 Y 次后进行检测全检，其余循环次数可取样不检或进行简单检测。空白运行样品只进行相应杂质残留检测。

3.2 检测方法及样品保存

根据样品确定检测项目，及样品取样后的保存(防止出现检测异常后的回顾与追踪)。

3.3 开展填料寿命验证试验

层析填料寿命的界定通常指在特定工艺条件下使用过程中，从开始使用时与设定的工艺指标发生偏差的使用次数。并不是所有循环次数的样品都要进行全检，可以每隔 N 次的留样样品进行全检，其余的循环次数的样品可进行简单的检测，比如层析图谱，蛋白浓度，SDS-PAGE 等。空白运行的样品可只进行相应杂质残留的检测。但是，每个循环次数的样品都要留样，留样体积及其保存温度可参考实际需求。

Maxtar^® ARPA寿命验证及 CIP 条件验证实验：

利用含有 FC 融合蛋白的细胞培养上清，对Maxtar^® ARPA 亲和层析介质进行了100个循环的不同 CIP 条件及寿命实验的验证。其中，CIP  条件见表1。

表1：不同的 CIP 再生条件

在100个循环试验内回收率在90%以上的初始水平，见图1。

图1：寿命验证-3组实验的回收率变化曲线

具有优异的 HCP 去除能力及较低的 protein A 脱落，样品的 SEC-HPLC 纯度较高，见图2。

在整个寿命验证实验中，Maxtar^® ARPA 在抗体纯化应用中表现了较高的稳定性。

图2：不同 CIP 方案的 HCP 去除，protein A 脱落，SEC 等性能比较

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