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层析介质寿命验证:方法、影响因素及案例分析


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近20-30年,生物技术在中国取得了巨大进展,生物制药也越来越被重视。生物制药的重要原材料是支撑整个产业链的基础,其质量、稳定性和供应能力直接影响药物的研发、生产效率和成本。其中,层析介质作为生物制药的重要原材料,对于实现生物制品的纯度、有效性以及安全性都非常重要,需要对其进行足够的控制以实现工艺性能和产品质量的一致性。


在生物分离纯化的过程中,通过层析介质的分离纯化得到目标产品,但同时相应的杂质也在层析介质中堆积。层析介质寿命的界定通常指在特定工艺条件下,从开始使用到使用时与设定的工艺指标发生偏差的使用次数。通过动态结合载量、宿主蛋白、核酸、脂类,培养过程的代谢产物、内毒素等指标进行判定。



寿命验证的必要性


  1. 成本控制:单次填料成本高达数十万元,延长寿命可显著降本

  2. 工艺稳健性:验证可确保填料性能衰减在可控范围内

  3. 合规要求:符合GMP、FDA/EMA对关键耗材的验证要求



层析介质寿命影响因素


1、物料的类型

2、层析介质的类型

3、层析柱的维护

4、层析系统的组成

5、层析柱装柱的质量

6、试剂的质量




寿命研究过程中缩小模型的建立及验证


首先,建立层析步骤的缩小模型,然后进行对应的缩小模型实验验证。缩小模型的建立基于层析比例缩放原则,保持同样的柱高、线性流速、上样载量、清洗和洗脱体积、柱效。模型的确认需要三次重复运行,并对实验室、中试和生产的性能参数平均值做作比较。数据显示,在不同规模性能下, 参数没有显著差异。缩小模型可以完整代表生产规模,适用于工艺表征研究。


缩小模型及层析介质的寿命和清洁验证可以同步进行。通过杂质残留、收率、肉毒素等检项判断,是否符合对应标准,是否符合对应缩小模型效价。缩小模型的建立及确认对大规模的层析有指导作用。



常规的层析介质清洁及维护

  1. 再生 恢复介质原有功能,在每个层析循环之后进行,根据介质的不同选择不同的缓冲液,如离子介质一般选择2M NaCl,疏水介质一般选择纯化水或低浓度的缓冲液。

  2. CIP 去除再生过程中不能去除的杂质,防止污染物的积累,通常1-10循环进行一次,不同的层析介质根据对应的产品说明书选择合适的缓冲液。

  3. 消毒 去除层析介质中的微生物,每批次的物料之间都要对介质进行消毒处理。一般的消毒方式是使用0.5-1M的NaOH 30-60min,部分不耐受NaOH的介质用其他方式进行消毒。目的是防止微生物的生长和去除内毒素。

  4. 保存 防止微生物和内毒素对介质的污染,用在非连续生产之间,根据介质的性质选择不同的缓冲液,一般为20%的乙醇或者0.01M NaOH。保存对介质寿命具有重要的作用。



介质清洗主要去除物质

介质清洗不同污染物对应不同的清洗方式,其中污染物主要包括可溶性杂蛋白、固化的蛋白、疏水性蛋白、脂类、核酸、色素、内毒素及微生物。



介质清洗验证

在介质清洗验证的过程中会加入空白对照检验清洗是否彻底。选择平衡缓冲液替代样品进行上样,收集对应的缓冲液。通过对收集液杂质残留,浓度等检相的检测判定清洗过程是否符合标准。空白对照可以检测清洗验证及防止杂质的持续累积。




案例分享一


百林科亲和填料

MaXtar® Protein A寿命验证


料液:深层过滤后的含有单克隆抗体的上清液

试验方案:对MaXtar® Protein A进行200个循环的测试,根据单抗平台工艺进行蛋白纯化,0.1M NaOH (140个Cycle后0.5M NaOH)消毒30min,循环结束后再生,每10个循环测试动态结合载量,收率,SEC,HCP,rProtein A脱落。

试验结果:在200个循环时收率在80%以上,符合预期标准;DBC对比初次下降仍在80%以上;SEC检测结果显示无显著变化;HCP的残留低于1000ppm;rProtein A脱落低于25ppm。

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案例分享二

 百林科阴离子填料

对病毒清除的寿命验证


阴离子交换层析中填料重复使用对鼠白血病病毒和鼠细小病毒的清除,在填料寿命的早期、中期、晚期阶段对填料进行检测。对上样样品进行调节。

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实验结果表明:病毒清除特性与填料重复使用150次无关。




百林科苏州应用中心简介

占地面积3000sqm,设有研发办公区、细胞培养实验室、微生物实验室、纯化实验室、中试车间、分析实验室。苏州应用中心致力于为客服提供上下游工艺开发,小试及中试规模样品制备,填料寿命验证及培训等服务。

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