浅谈mRNA的工艺设计及工艺优化

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在新冠疫情的影响下，mRNA药物发展速度显著增快，已为广大从业者和患者熟知。目前mRNA技术广泛应用于传染病疫苗、肿瘤疫苗、免疫调节药物、CAR-T和抗体药物。mRNA原液的生产工艺主要包括质粒的线性化、体外转录和mRNA纯化，其中体外转录是原液生产的核心，决定了产品质量和纯化工艺的选择。

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图1 mRNA工艺概览

质粒生产工艺较为成熟，百林科经典三步法和两步法工艺都有成功的案例

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图2 质粒生产工艺

质粒线性化阶段使用限制性内切酶将超螺旋的质粒DNA线性化，避免体外转录时T7 RNA聚合酶转录环形的质粒DNA目标序列下游序列，从而产生长度不一的产物。

此步骤中原料质粒DNA的质量、线性化条件（质粒浓度，酶浓度，温度，孵育时间等）会影响线性化质粒的质量属性，继而影响体外转录的mRNA质量。

线性化质粒纯化需要去除的杂质主要是未酶切完全的质粒、以及酶切工艺引入的酶。通常使用疏水、反相及质粒亲和层析可以有效分离线性化和超螺旋质粒，并可去除酶。通过优化酶切工艺，可以实现质粒的完全线性化，只需要去除限制性内切酶即可。在此条件下，多模式层析（Coll系列）和阴离子交换也可以满足工艺的要求。

完成纯化后，线性化质粒通过切向流超滤完成缓冲液置换和浓缩，达到体外转录的要求。线性化质粒可以耐受较高的剪切力，可以选用膜包和中空纤维。需要注意线性化后质粒，更易穿过膜上的截留孔，需要选择更小截留分子量的滤器，以保证收率。

体外转录将核苷酸原料在T7 RNA聚合酶作用下合成为mRNA，此后使用DNA酶消化去除模板DNA。广泛采用的共转录加帽也在此阶段完成。转录后加帽工艺则需要进行mRNA纯化、超滤换液后，再进行酶催化加帽。体外转录后纯化需要去除的杂质主要是工艺中所添加的蛋白（T7聚合酶、焦磷酸酶、DNA酶、RNA酶抑制剂等）和产品相关杂质（dsRNA和截断的RNA片段）。蛋白类杂质与RNA性质差异较大，较容易去除；产品相关杂质会降低翻译效率，并具有免疫原性，且与目的mRNA性质接近，是纯化工艺的主要挑战。

体外转录的原料及条件不仅决定mRNA的产率，也影响产品相关杂质的水平。RNA分子序列设计、不同厂家T7 RNA聚合酶选择和用量、线性化质粒模板浓度、反应时长和反应温度、反应缓冲液成分尤其是镁离子浓度等都是体外转录需要优化的因素。其中酶是该工艺的关键因素之一，不同来源的酶转录后mRNA产量和dsRNA含量可能有较大的差异。除上述提及的因素外，在缓冲溶液中加入适量的尿素等试剂也有助于降低dsRNA的含量。

工艺放大后与实验室工艺最大的区别在于反应容器的差异及由此带来的温度控制的精度。实验室条件摸索时小于1ml体系通常使用PCR仪或金属浴保温，1ml至几十ml体系通常使用水浴锅或恒温摇床等。不同的保温方式，反应体系的温度精度及体系中温度分布也不同，在工艺放大中通常会影响工艺表现。

GMP生产中通常选用一次性无核酸酶袋作为容器，温控设备可以使用摇摆式生物反应器、搅拌式生物反应器或一次性配液系统，但不同方式温控效果存在差异，升温降温速率等参数的设置也需调整以保证体外转录反应的表现。

原液生产中的纯化工艺，由体外转录的产品质量水平及目标产品质量标准决定。目前已知的纯化工艺存在较大的差别，但主要是层析及超滤的组合。比如BioNTech选择使用蛋白酶K降解体外转录中加入的酶，仅通过两步切向流过滤就完成纯化。Moderna则使用亲和层析和离子交换层析进行纯化，最后使用超滤洗滤进行浓缩换液。

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图3 BioNTech和Moderna的mRNA生产工艺

目前工艺设计更多选择在分子设计筛选和体外转录阶段进行优化，降低mRNA原液纯化的压力。

在下游纯化阶段，最广泛应用的是poly dT亲和层析，可以同时起到去除产品相关杂质及工艺相关杂质的效果。不同厂家dT亲和填料的孔径大小、配基长度、配基密度存在差异，在载量、收率和纯度上的表现也各有不同，选择时需综合考虑。理想情况下，体外转录有效控制产品相关杂质水平时，也可以选用多模式层析（Coll系列）代替亲和层析去除工艺相关杂质。其他有报道可以去除dsRNA等产品相关杂质的阴离子交换、离子对反相、疏水层析等，都因为技术本身载量、分辨率、成本等劣势，应用受到限制。随着新RNA分子形式的出现，在dT亲和层析无法达到纯化目的时，基于序列特异性定制亲和填料的案例也越来越多。受RNA分子本身特征的影响，通常定制填料会选择有较大孔径基球。

切向流过滤作为RNA纯化必备的步骤，需要结合分子稳定性和吸附特性选择膜包或中空纤维。对剪切力敏感的分子适合选用中空纤维，根据材质吸附情况选择膜包或中空纤维的材质，由于RNA的构象特征通常选择较小的截留孔径以保证收率，而膜面积的选择需要考虑分子稳定性和工时。在确定工艺参数时，需要注意RNA料液浓度相比蛋白料液明显较低，跨膜压设置通常较低以避免迅速的浓差极化。

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