解锁病毒载体下游纯化工艺路线

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病毒载体是一种，常使用于分子生物学的工具，可将遗传物质带入细胞。可发生于完整活体或是细胞培养中。其原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制。常应用于基础研究、基因疗法或疫苗相关产品中。

目前在人用药物领域已经有多种病毒被开发成为临床可用的递送系统。目前，比较常用于临床或临床试验的病毒载体主要包括：腺病毒（AdV）、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒(RV)、慢病毒(LV)、单纯疱疹（HSV）等，纯化工艺流程如下图：

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病毒颗粒纯化是一项有挑战性的工作，下游纯化不仅需要将相关杂质例如HCD，HCP，质粒DNA等去除，还要面对病毒颗粒聚集，包膜破坏，空实心，稳定性等等一系列挑战。

腺相关病毒（AAV）载体

腺相关病毒是一种非致病性病毒，安全性好、宿主范围广、物理性质稳定，可长期稳定的表达外源基因，在基因治疗中得到广泛应用的载体[1]。

病毒收获时，通过物理或化学方法裂解细胞，常见多用吐温或曲拉通，AAV从裂解的宿主细胞中释放出来，深层滤器澄清过滤后，使用全能核酸酶对残留的核酸片段剪切，此步骤需保证良好的温度与作用时间，法规要求，核酸片段应切至200bp以下。再经TFF换液浓缩，此工艺环节，要避免浓缩倍数过高，引起病毒颗粒聚集，常规浓缩倍数要小于10倍；同时还要保证较低的剪切力，以免对病毒活性损伤，百林科的TFFNOVA^® 中空纤维膜是非对称结构，膜层致密，外层相对开放。其独特的结构设计可以使得生物负载更低，非特异性吸附更低，过滤速率更快，通量更高，过滤时间更短，能有效的用于病毒颗粒的换液与浓缩。

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百林科TFFNOVA^® 中空纤维过滤器

之后是两步层析，AAV捕获阶段建议使用MaXtar^® AAV/MaXgo^® AAV对病毒进行捕获。此步骤可加入适量添加剂例如精氨酸，甘油等，以防止病毒颗粒聚集或吸附于流路管壁。精纯采用MaXtar^® Q 进一步进行除杂，去除HCP，HCD，并进行空壳与实心的分离，空壳实心的分离常因不同的添加剂表现出不同分离效果，建议使用MgSO₄或Na₂SO₄等改善空壳与实心的分离效果；另外此步工艺需保证较低的上样电导，以期病毒颗粒完全挂柱，避免流穿。MaXtar^® Q是一款强阴离子交换层析介质，相比于传统的强阴离子交换层析介质，MaXtar^® Q表现出更优的性能：改良的MaXtar^® 基架具有更强刚性，因此在较低的反压下能够实现更高工艺流速，提高工艺效率；通过升级配基偶联方式，提高层析介质的动态结合载量。最后再进行TFF与除菌过滤，完成原液制备。

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腺病毒（AdV）载体

腺病毒载体是经基因重组改造复制缺陷的腺病毒载体系统。腺病毒载体的优势在于：感染效率高且可以感染分裂的和非分裂的细胞，包载量大，不会有整合到人体基因组的随机整合潜在风险，转录表达时间较快，工业化生产易于放大，作为疫苗载体，腺病毒有较强免疫原性^[2]。其下游纯化工艺与AAV主要工艺区别在于两步层析工艺，由于腺病毒粒径较大，通常为70-90nm的颗粒，层析部分，第一步可采用阴离子层析即使用MaXtar^® Q进行捕获，这一步可完成病毒颗粒的捕获与部分除杂。第二步可直接使用多模式层析MaXtar^® COLL 400/700进行精纯，可有效去除HCD，HCP等杂质。MaXtar® COLL 400/700是一款多模式层析介质。相比于传统的单一模式层析介质，MaXtar^® COLL表现出更优的性能：独特的双层结构设计，以流穿模式处理400KD/700KD以上的大分子，工艺优化更容易，更方便线性放大。改良的MaXtar^® 基架具有更强刚性，因此在较低的反压下能够实现更高工艺流速，提高工艺效率。相比于传统的凝胶过滤层析，拥有更大的上样量，降低成本。后续工艺再进行TFF换液浓缩，除菌过滤，完成原液制备。

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慢病毒（LV）/单纯疱疹病毒（HSV）载体

慢病毒载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力^[3]。单纯疱疹病毒载体是溶瘤病毒的一种。溶瘤病毒是近年兴起的一种新型肿瘤基因治疗生物制剂。研究证实，溶瘤病毒能够感染并使某些肿瘤细胞溶解破坏，而在正常组织细胞中既不复制也无破坏杀伤作用^[4]。类似像慢病毒，疱疹病毒，与其他病毒载体最大区别是它们是一类有包膜，且此包膜容易在纯化过程中破坏，从而大大影响病毒颗粒活性；并且病毒颗粒大，约为100-200nm，甚至大于300nm。

因此，对下游纯化是巨大的挑战。在层析部分中首选多模式层析MaXtar^® COLL 400/700，能够无压力的将大粒径的病毒和较小的杂质进行分离去除。该填料在客户某溶瘤病毒的纯化中取得了良好的效果，滴度与杂质残留符合客户要求（如下图）。

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溶瘤病毒的纯化案例

在TFF工艺阶段中由于包膜对剪切力的敏感性，建议控制剪切力不超过3000 1/S，推荐使用百林科TFFNOVA^® 中空纤维膜并搭配FiltraLinX^® 桌面型半自动中空纤维超滤系统。

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百林科FiltraLinX® 桌面型半自动

中空纤维超滤系统

以上基本涵盖了主流病毒载体纯化的要点与难点，在面对不同的病毒颗粒纯化时，可灵活选取不同填料，调整工艺顺序，使终产品符合相关滴度，纯度，杂质去除等等质控标准的要求。

百林科苏州应用中心简介

占地面积3000sqm，设有研发办公区、细胞培养实验室、微生物实验室、纯化实验室、中试车间、分析实验室。苏州应用中心致力于为客服提供上下游工艺开发，小试及中试规模样品制备，验证及培训等服务。

参考文献

【1】Wang J H , Gessler D J , Zhan W ,et al.Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases[J].Signal Transduction & Targeted Therapy, 2024, 9(1).DOI:10.1038/s41392-024-01780-w..

【2】张茗婧.腺病毒载体肺炎疫苗的构建及免疫评价研究[D].天津科技大学,2023.DOI:10.27359/d.cnki.gtqgu.2023.000296.

【3】房恩岳,张丽萍,马雪征,等.慢病毒载体系统及其安全性研究进展[J].病毒学报,2023,39(04):1181-1192.DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.004349.

【4】吴振,张紫怡,汪洋,等.重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒纯化工艺的建立[J].中国生物制品学杂志,2018,31(05):552-554+562.DOI:10.13200/j.cnki.cjb.002184.

文章封面图片来源于站酷海洛

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