重组大肠杆菌高密度培养关键点解析

由于以葡萄糖为碳源时，大肠杆菌生长速度快且糖浓度测定方法简单。因此，葡萄糖是大肠杆菌发酵最常用的碳源。值得注意的是，以葡萄糖为碳源进行高密度发酵时，需要严格控制其浓度。培养基中残糖浓度过高，糖代谢会生成大量的乙酸，从而影响菌体的生长和产物的生成。相比之下，甘油代谢速度比葡萄糖慢，产酸更少，能更温和地启动发酵，是减少乙酸积累的有效策略。

氮源包括复合氮源和无机氮源。复合氮源（酵母提取物（YE）、蛋白胨）富含氨基酸、维生素、微量元素和生长因子，能显著促进菌体快速生长，提高最终密度。但成本高，成分不完全明确，可能增加下游纯化难度。无机氮源（硫酸铵）成分明确，成本低且易于下游处理。但因缺乏生长因子，菌体生长速度和最终密度可能受限。因此，发酵过程中常使用混合氮源，既能提供生长因子，又能降低成本并提供充足氮源，兼顾双重优势。

在发酵培养基中，无机盐是构建细胞和维持基本生理功能的骨架，而微量元素则是精细调控代谢、特别是目标产物合成的钥匙。它们的需求量大不相同，但都遵循“适量有益，过量为毒”的原则。在实际的发酵工艺开发和优化中，有效控制无机盐和微量元素种类与浓度，是提高菌体密度和产物产量的关键步骤之一。

在培养过程中，为了使大肠杆菌达到较高的密度，培养过程中往往需要向反应器中补充浓缩后的新鲜培养基，补充菌体生长所必须的营养成分。

指数流加补料是一种基于强大理论模型的预测性高级发酵策略。它通过使补料流速与微生物的指数生长趋势同步，实现了对细胞代谢的精确控制，是高密度培养重组大肠杆菌以生产高价值蛋白的黄金标准方法之一。尽管它对设备和技术要求更高，但其在提升产量、质量和工艺重复性方面的巨大优势，使其成为现代生物制造领域的核心技术。主要应用于高要求生产、科研、工艺优化等方面。

反馈补料系统是一个典型的闭环控制系统，包含三个基本部分：

• 实时监测发酵液中的某个关键参数（如溶氧DO、pH、尾气等）；

• 接收传感器的信号，并将其与一个预设的设定值进行比较。根据比较的偏差，通过特定的控制算法（如PID控制）计算出需要采取的action；

• 接收控制器的指令并执行（通常是调节补料泵的转速）。这个循环不间断地进行，从而实现过程的自动优化和稳定。

总而言之，指数补料定义了“理论上”的最优路径，而反馈补料则像是汽车的巡航系统和导航系统，不断监测现实路况（传感器信号），并自动调整油门（补料泵），确保车辆始终行驶在最优路径上，即使遇到上坡、逆风等意外情况也能从容应对。在实际生产中，也常将两者结合，即采用指数补料作为主策略，同时用反馈信号（如RQ）对其进行微调。

在许多重组蛋白表达系统中，目的基因被放置在一个可诱导的启动子下游。在诱导前，该基因几乎不表达（“渗漏表达”极低）；加入特定的诱导剂后，启动子被激活，基因开始大量转录和翻译。选择合适的诱导方式和诱导剂直接决定了重组蛋白表达的成败、产量和可溶性。诱导不仅仅是“加东西”那么简单，需要精细优化：

菌体已生长到足够密度，但尚未进入稳定期、营养也未耗尽。通常用OD600来衡量，一般在对数生长中期或后期（例如OD600=0.6-1.0）。 过早诱导，菌量不足，总产量低。过晚诱导，菌体活性下降，代谢副产物积累，表达效率低。

需要针对每个蛋白进行优化。IPTG常用浓度范围0.1 - 1.0  mM。高浓度并非总是更好，有时低浓度缓慢诱导有助于可溶性表达；阿拉伯糖：常用浓度范围0.0002% - 0.2%（w/v），可精细调节表达水平。

温度是影响蛋白可溶性的最关键因素。高温（37 °C）表达速度快，产量可能高，但容易形成包涵体（不溶性聚集体）；低温（16-25 °C）表达速度慢，但能促进蛋白正确折叠，大幅提高可溶性比例。通常诱导后立即降温。

通常4-24 h。时间太短产量不足；时间太长菌体可能裂解，蛋白酶降解蛋白。

诱导是重组蛋白表达的“临门一脚”。IPTG诱导的T7/T5系统因其强度高、技术成熟，仍是大肠杆菌中最主流的方案，尤其配合低温诱导策略来获取可溶性蛋白。对于特殊需求（如毒性蛋白、无化学品残留），则应考虑阿拉伯糖系统或乳糖。最终的最佳条件必须通过实验优化（诱导OD、诱导剂浓度、温度、时间）来确定。

大肠杆菌高密度发酵最终成功指标，不仅是高菌体密度（如DCW > 50 g/L），更是高的目标蛋白产量和质量（如占菌体总蛋白的20%-30%以上，且具有高活性）。这需要通过反复实验，对诱导时机、温度、诱导剂浓度和补料策略进行精细优化才能实现。

占地面积3000sqm，设有研发办公区、细胞培养实验室、微生物实验室、纯化实验室、中试车间、分析实验室。苏州应用中心致力于为客户提供上下游工艺开发，小试及中试规模样品制备，验证及培训等服务。