走进卓越工艺开发与验证中心：可放大的核酸发酵方案

以全链服务赋能，助力制药产业前行

百林科卓越工艺开发与验证中心（原百林科苏州应用中心）是百林科集团在技术创新与工艺开发领域的重要布局，集工艺研发、分析检测、中试放大于一体，致力于为制药行业提供全流程解决方案。

《走进卓越工艺开发与验证中心》系列文章，将系统介绍卓越工艺开发与验证中心在上下游工艺开发、分析质控及技术转化等各环节的技术积淀与服务能力，呈现百林科如何以系统性创新赋能产业发展。

图1：百林科卓越工艺开发与验证中心

｜本期聚焦｜

百林科卓越工艺开发与验证中心，具备完整微生物发酵与纯化中试验证能力。面向质粒 DNA、工程化 dsRNA 两类主流核酸原料，中心落地一套线性可放大、参数可溯源、批次稳定性优异的大肠杆菌发酵生产工艺，针对性解决放大过程菌体密度偏低、核酸拷贝不足、副产物堆积、批次波动明显等行业痛点。整套工艺以分级扩培、溶氧优先、梯度补料、精准诱导、低温保稳为核心逻辑，全程遵循工业化放大相似性准则，可在中心完成全流程工艺开发与中试验证。

生产体系与设备选型（核心基础）

工程菌株：选择合适的表达载体与宿主构建工程菌株是发酵生产的前提条件。质粒DNA生产会选择高拷贝质粒（pUC系列、pLP2）搭配克隆型宿主菌株（DH5α、Top10、XL10-Gold），实现无外源蛋白表达干扰的质粒大批量表达；RNA（dsRNA）生产选择HT115、BL21(DE3) 工程改造菌株（RNA酶缺陷型，保证产物不会被降解），适配T7启动子、噬菌粒复制系统。
培养基配方：采用改进的TB复合培养基+甘油补料体系。优势在于缓冲体系稳定，可耐受高密度发酵pH波动；甘油为缓释碳源，大幅减少乙酸等有毒副产物累积，可以显著提升核酸拷贝数。
设备选型：小试工艺摸索、参数定型（5L/10L 发酵罐）；中试工艺验证、稳定性测试（50L/100L 一次性生物反应器、不锈钢发酵罐）；规模化量产（200L–1000L+ 工业级发酵系统）
核心配套模块：在线溶氧（DO）、pH、温度、搅拌转速、进气流量实时监测系统，自动补料、消泡、温控联动模块，满足自动化生产需求。

分级放大发酵工艺流程

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图2：发酵放大分级流程

流程说明

全程阶梯式扩增、逐级放大，每一级均固定传质、溶氧、培养参数，保证小试、中试、量产环境一致，彻底解决放大偏差问题

1、种子扩增阶段（无菌核心，决定批次稳定性）

必须遵守逐级放大、接种量受控、活力最佳时转接（菌体对数生长中期）、工艺环境一致（pH\温度\溶氧）、无杂菌污染、批次稳定的原则。其中种子甘油菌的平板划线，挑取单菌落进行发酵是批次间稳定性的关键步骤，不可为缩短生产周期而省略。

2、发酵罐生产阶段（核心放大工艺）

菌体生长期：温度37℃、pH7.0±0.2、DO维持30%–40%；通过搅拌转速（200–800rpm）与进气量联动控制溶氧，利用基础培养基碳源实现菌体快速生长。
梯度补料生长期：启动梯度补料，初始补料速率1–3g/L/h，2h内逐步提升至5–7g/L/h，持续补充碳源与氮源。全程严控DO≥30%，pH稳定，此阶段菌体密度持续提升，为核酸复制积累生物量。
核酸诱导富集期：质粒DNA产品，需要降低温度和补料速度、维持低代谢压力，提升质粒拷贝数；RNA产品需要添加诱导剂，启动dsRNA的表达。
收获：OD600稳定不再上升、核酸产量峰值期，立即终止发酵。低温离心收集菌体，避免核酸降解。

关键放大参数

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表1：主要参数

核酸发酵工艺，可根据产品类型灵活微调：质粒DNA可优化低温富集时长提升拷贝数；RNA产品可优化诱导温度、IPTG浓度提升转录效率；同时兼容一次性反应器与不锈钢反应器。

放大技术要点

杜绝放大效应偏差：采用反应器逐级扩培，严格遵循kLa恒定原则，从根源消除批次差异。
副产物精准控制：甘油为碳源，搭配梯度补料工艺，抑制大肠杆菌溢流代谢，避免高乙酸导致的菌体生长停滞、质粒拷贝数下降、RNA降解等问题。
核酸稳定性保障：发酵后期降温富集，终点及时收获，全程低温处理，保障产物完整性。

上述整套可放大工艺落地生产，从上游发酵罐体、层析填料到配套工艺耗材，百林科可提供全链条国产化产品与一站式落地服务。依托上述配套产品与工艺方案，我们在卓越工艺开发与验证中心和客户现场完成多批次中试验证。

1、上游发酵：CytoLinX® 系列 0.3L-2000L生物反应器

CytoLinX^® GB 台式玻璃反应器（小试研发）

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图3：CytoLinX^® GB台式玻璃生物反应器

精准控温 / 控 pH / 控溶氧，程序自动加料，批次一致性拉满；釜式设计贴近生产，小试数据直接放大，无工艺断层；适配大肠杆菌 / 酵母菌，质粒发酵 OD₆₀₀可达 80+，scDNA 占比≥90%。

CytoLinX^® BR 一次性罐体式反应器（中试/大规模生产）

图4：CytoLinX^® BR 一次性罐体式反应器

高效气液传质，溶氧稳定≥30%，高密度发酵 OD₆₀₀突破 80；全自动化控制：温度 /pH/ 溶氧 / 搅拌 / 补料实时闭环，无人值守；模块化设计，快速切换体积，研发→生产无缝衔接

2、下游纯化：MaXtar^® 层析矩阵，高纯度 scDNA/mRNA 一步到位

质粒三步法：Chromstar^® 6FF 凝胶过滤填料 → PlasmidCap HR → Q HR，scDNA 纯度≥99%，内毒素 < 0.1EU/mg

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mRNA 两步法：Maxgo Oligo dT → Phenyl HR，捕获效率≥90%，完整 mRNA 占比≥95%，一次性预装柱 / 填料，同工艺直接放大，无需重新开发。

卓越工艺开发与验证中心案例分享

应客户要求，百林科卓越工艺开发与验证中心以自主上下游产品为基础，完成了质粒发酵、纯化制备和CHO细胞瞬转表达工艺，最终成功获得目标蛋白。以下为相关实验过程。

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图5：菌体生长曲线图

接种后8.7小时，溶解氧值降至设定点（30%），随后空气和氧气通过预设级联控制自动供应流量；开始时的补料速率设定为0.2 mL/min，并每2小时手动增加10%至15%，以保持细菌特异生长率（μ）在0.06至0.08/h。菌体增长曲线如图所示，培养结束时OD600达到89.2，质粒表达量58mg/L。

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