重组蛋白的包涵体复性与纯化

包涵体定义

80%以上的外源基因在E.coli中过度高效表达，由于产物缺乏翻译后的糖基化功能的加工，缺少自我复制的能力，不能正确的折叠，使得蛋白质溶解度下降，在细胞中形成不溶于水，无生物学功能的蛋白质聚集体即为包涵体(inclusion body)。

包涵体溶解，变性蛋白

包涵体的溶解对蛋白复性有重要影响，是成功复性与纯化的重要因素。

包涵体要正确折叠，首先必须溶解包涵体，将错误折叠的重组蛋白包涵体以多肽链形式自由伸展，使蛋白质变性。蛋白质变性的实质是氢键、二硫键、疏水键，离子键等作用力被破坏，疏水基团暴露，破坏了原有的空间结构，使蛋白质的物理及化学性质发生改变和生物学功能丧失的变化。

包涵体溶解常用的方法有6~8mol/L尿素或4~7mol/L盐酸胍、极端pH、去污剂、和有机溶剂等。高浓度变性剂6~8mol/L尿素或4~7mol/L盐酸胍通过破坏分子间及分子内的氢键、疏水键及离子间作用，使疏水基团暴露、破坏空间结构使蛋白质变性。对含有二硫键的蛋白质要同时加入还原剂如巯基乙醇(β-ME)，二硫苏糖醇(DTT)来打开蛋白质分子内及分子间的二硫键(disulfidebonds)，使蛋白质分子完全以多肽链的形式伸展开。在极端pH条件下蛋白质的次级键被破坏，使多肽链相互分离，而去污剂如十二烷基磺酸钠(SDS)及十六烷基三甲基铵氯化物(CTAC)和有机溶剂破坏了重组蛋白的多肽链之间的疏水作用，使多肽链自由伸展开。

包涵体层析复性

01、层析复性定义

蛋白复性或蛋白重折叠是指变性蛋白去除变性剂，由变性蛋白的热不稳定状态向热力学稳定稳定状态方向折叠，恢复原有的空间构象和生物活性的过程。层析复性是将变性蛋白结合在层析柱上呈单分散状态，避免分子之间的相互作用，减少变性蛋白聚集，完成蛋白复性。

02、层析复性优势

层析复性具有：除去变性剂，与杂质分离，复性蛋白等三重作用。在相对较高浓度下复性变性蛋白，适合规模化生产，是一种高效，灵活的复性方法。

03、层析复性工艺开发策略

层析填料

凝胶层析复性蛋白在凝胶孔隙中缓慢折叠，避免分子碰撞，适合多结构域蛋白；疏水层析复性蛋白通过疏水作用吸附在填料上，变性剂梯度洗脱时逐步折叠，同步去除杂蛋白；离子交换层析复性蛋白通过电荷吸附在填料上，变性剂梯度洗脱时逐步折叠，同步去除杂蛋白；亲和层析复性借助His、GST等标签实现蛋白特异性固定，适合高价值药用蛋白或难复性蛋白。

复性缓冲液

复性缓冲液不禁提供蛋白折叠的复性环境，还为蛋白正确折叠提供合适的pH，离子强度等条件，还抑制蛋白聚集。