Protein A亲和填料的清洁和寿命

得益于Protein A 亲和填料对抗体的高选择性和体积去除率以及稳健的杂质去除效果。Protein A 亲和填料作为抗体药生产的行业标准。由于Protein A结合能力的局限性以及与Protein A树脂相关的高成本，提高填料使用寿命的需求变得尤为重要。一般认为Protein A 填料的重复使用寿命由填料水解和填料污垢两个因子所影响。

Protein A填料水解是指配基长时间暴露在清洁溶液（如氢氧化钠）中的降解。Protein A填料污垢是由于使用无效清洗液导致杂质在填料表面不断积累导致。

图1，氢氧化钠浓度和温度对DBC的影响

图2，使用添加剂来延缓配基的水解

选定不同的添加剂对配基水解具有不同的延缓效果，以分子E为代表，分别添加蔗糖、乙二醇和丙二醇作为氢氧化钠的添加剂，评估其清洁液循环之后的DBC。由图3可知，添加剂对配基水解的延缓有一定的作用，丙二醇/蔗糖和乙二醇的配体稳定性分别比0.1 M NaOH的基础情况提高了2倍和3倍。

图3，比较碱性清洁溶液和

非碱性清洁溶液的填料污垢

选定3种分子（1个单抗+2个Fc融合蛋白）做为代表研究填料清洗后的污垢。为了最大程度上污染层析柱，3个代表分子的澄清收获液在Protein A的层析柱上进行10个cycle，每个cycle只做到洗脱步骤，没有做层析柱清洁，最后将层析柱拆下来分装，分别用不同清洗液在不同温度下孵育2小时，并用平衡液清洗3次，用原始的填料作为对照。此时填料上残余的是清洗不干净的污垢。将最后的填料悬浮液稀释到1倍的SDS PAGE loading buffer中，80℃孵育10分钟后取上清并进行SDS PAGE分析。SDS PAGE上越多蛋白表示越多的清洗不干净的污垢。

从图4中可以清楚地看出，0.1M和0.3M(泳道2、4、5)浓度较高的氢氧化钠作为清洁溶液的效果明显优于0.02M (泳道3)。这一趋势在所有3种测试分子中都是一致的。0.3M NaOH对分子A的反应优于0.1M NaOH，但对其他两种情况的反应相当。此外，pH 11非碱清洗液(泳道 6)对分子A的清洗效果良好，但对其他分子的清洗效果不佳。这支持了无碱清洗液不适合作为平台清洗策略的理论。有趣的是，温度并没有影响树脂清洗的效率。在更高浓度的氢氧化钠(0.3M)下，在环境温度和低温(泳道4和5)下都获得了类似的结果。

图4

为了更好表征清洗时间对清洗效果，继续以分子B为代表（Fc融合蛋白，pI 7.9), 用B分子污染的填料分别不同孵育时间。如图5所示，随着孵育时间增加，泳道的蛋白越少，清洗效果越好。但是增加孵育时间可能导致更多的配基降解，所以孵育时间和配基降解应该综合考虑以取得最佳的填料寿命。

图5，填料寿命研究

根据以上数据，选定0.1 M NaOH和0.1 M NaOH+20% EtGly为清洁溶液，评估其使用次数。由图6可知，在添加了20% EthGly情况下层析柱寿命几乎翻了一倍，且产品质量未见下降。使用乙二醇作为添加剂来清洁亲和层析柱会导致洗脱体积随着循环数增加而缓慢增加，洗脱体积不影响相应的产品质量，所以乙二醇任然可以作为亲和层析的清洁添加剂。

图6

图7

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