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应用指南:如何构建高效的瞬转平台


应用分享banner.png细胞转染是指将外源分子(如DNA,RNA等)导入(真核)细胞的实验技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已应用于研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学实验中。


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细胞转染原理图


瞬转的基本原理


瞬时转染是将DNA导入宿主细胞的技术,其特点是载体基因不整合到细胞基因组上,而是随着细胞分裂而逐渐丢失。瞬时转染可在短时间内获取目的基因的表达产物,目前常用的瞬转方法有化学试剂转染,脂质体转染,病毒载体转染和电转等。


PEI(聚乙烯亚胺)为化转试剂之一,其原理是带正电的PEI能将带负电的DNA包裹成为带正电的PEI-DNA复合物,PEI-DNA复合物可结合细胞表面通过胞吞作用进入细胞,PEI相比于其他转染试剂有着成本低廉的优势,因此被广泛应用。


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瞬时转染示意图


瞬转的表达系统


细胞在导入表达载体后不经选择培养,载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失,目的蛋白的表达时间较短,相对于稳定表达系统,瞬时表达系统无需将外源基因整合到基因组上,避免了外源基因整合过程中位置效应的影响。瞬时转染一般用于基因产物的短期表达,进行蛋白质小规模合成。


那么如何能快速地搭建瞬转平台呢?

主要分五步:载体构建→质粒抽提→细胞准备→瞬时转染及细胞培养→纯化及质量检测



载体构建

首先要选择合适的载体,为了使质粒能够在细胞中进行自我复制,提高瞬转的表达量,需要选择与宿主细胞匹配的表达载体,另外,为了提升表达量,表达载体通常选择含强启动子的。


如果表达的蛋白含有多条链,可以将两条或两条以上的链构建到一个载体或者多个载体进行表达。在构建时需要注意的点是,目标基因前面加上信号肽和 kozak 序列,构建的过程中尽量使用同源重组的方法防止移码突变,目的基因最后必须加终止密码子。


质粒抽提

对于少量的质粒抽提,可以选用控内毒的质粒抽提试剂盒,现在一些国产的试剂盒完全可以满足实验的需要。对于大量的质粒抽提,可以使用层析的方式,百林科拥有完善的质粒纯化平台,可以针对不同的实验要求,提供差异化的质粒纯化解决方案。


抽提的质粒通过跑分子胶鉴定大小及纯度,OD260/OD280 以及 OD260/OD230 确定质粒的质量。百林科质粒纯化平台三步法:分子筛(Chromstar® 6FF)+亲和(MaXtar® Plasmidcap HR)+阴离子(MaXtar® Q HR) 能协助客户解决大规模质粒纯化制备的问题。


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细胞准备

目前常用的瞬转表达宿主为 CHO 细胞和 HEK293 细胞,均有耐受较高剪切力和渗透压,表达水平较高,支持悬浮培养的优点。HEK293 细胞相对于 CHO 细胞在转染效率方面更有优势,由于 HEK293 为人源细胞,适用于表达翻译后修饰要求更高的重组蛋白。


CHO 细胞为鼠源细胞,比 HEK293 细胞生长更快,外源蛋白分泌更少,分离纯化更简便,且 CHO 细胞在放大生产方面相比于 HEK293 细胞更为稳定,因此大多数研究者选择用 CHO 细胞作为抗体类药物的瞬转表达宿主。



瞬时转染及细胞培养

瞬时转染的方法有很多,现在最常用的方法为 PEI 转染。选用转染效率高的 PEI 很关键。使用 DOE 的方法确定转染细胞的密度,质粒和 PEI 的用量,确定质粒和 PEI 孵育的时间。


转染完成后进行细胞培养,添加 Enhancer 和补料,培养周期根据蛋白的累计效果及稳定性来确定。培养结束后用 SEC-HPLC,Biacore 或者 Elisa 的方法检测表达量。


纯化及质量检测

带标签的蛋白可以通过亲和填料纯化得到目标蛋白,不带标签的可以通过离子交换,复合模式,或者疏水填料分离得到目标蛋白。得到目标蛋白后进行质量分析,通过 SDS-PAGE 和 SEC-HPLC 初步分析蛋白的质量。


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搭建瞬转平台时使用 GFP 质粒测试转染效率


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瞬时转染由于不需要质粒稳定整合到基因组形成细胞株,运用这种方法能在短时间内制备出蛋白样品,用于蛋白功能和稳定性的检测。这一方法被广泛运用于药物研发的早期阶段。同时在威胁公共卫生的突发传染病的预防和治疗方面可以在短期内完成临床前药物开发,大大缩短药物的研发周期。搭建高效的瞬转平台对项目的快速推进影响深远。


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