GLP-1降糖减肥神药简介及纯化工艺梳理

近年来，新型降糖药GLP-1类药物成为降糖领域重要靶点。GLP-1药物是降糖减肥的一类重要药物类别，兼顾降糖、减重成为治疗新趋势，市场火热，由于其多肽内在属性决定的相对较高的安全性，将注定成为未来相当长一段时间内降糖减肥药的翘楚。

GLP-1RA (glucagon-like peptide-1 receptor agonist，GLP-1RA) 是目前重要的降糖减肥药物之一，可刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌,是美国 DM 协会和中华医学会 DM 学分会推荐的强效降糖药物^[1-2]。

胰高血糖素样肽 (glucagon-like peptide，GLP-1)是一种由肠道分泌的内源性肽类激素，可与受体结合促进胰岛素分泌，起到生理性降糖作用^[3],GLP-1RA是对 GLP-1 结构进行修饰所得到的，延长了其半衰期，提高了体内活性 GLP-1 水平，使其达到有效浓度，可改善胰岛素敏感性、降低血糖、血压及体质量^［4]。

GLP-1RA 包括艾塞那肽 (exenatide)、利西那肽 (lixisenatide)、利拉鲁肽 (liraglutide)、杜拉鲁肽 (dulaglutide)、索玛鲁肽(sermaglutide) 及阿比鲁肽 (albiglutide) 等^[5]，也可以通过直接延缓胃肠道吸收和刺激迷走神经，抑制胃泌素和进食，减少食物摄入，刺激棕色脂肪组织产热和白色脂肪组织褐变，增加能量消耗^[6]，进而帮助控制体质量。

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图1. GLP-1治疗对肥胖患者的影响 (Drucker, D. 2021)

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图2. 利拉鲁肽的分类体重减轻摘要(Drucker, D. 2021) ∗: p < 0.001，OR: odds ratio，†:糖尿病前期个体，‡：低热量饮食（1200-1400kcal/天），数据来源^[8-12]。

据不完全统计，国内有20多款适应症为2型糖尿病的GLP-1类多靶点创新药在研，其中，恒瑞医药的诺利糖肽均已在III期临床阶段，信达生物/礼来的IBI362、恒瑞医药的HRS9531则处于II期临床阶段。

GLP-1单靶点竞争非常激烈，近一半产品是GLP-1单靶点，单度拉糖肽、司美格鲁肽的生物类似药就十几个。

据不完全统计，国内有20多款适应症为2型糖尿病的GLP-1类多靶点创新药在研，其中，恒瑞医药的诺利糖肽均已在III期临床阶段，信达生物/礼来的IBI362、恒瑞医药的HRS9531则处于II期临床阶段。GLP-1单靶点竞争非常激烈，近一半产品是GLP-1单靶点，单度拉糖肽、司美格鲁肽的生物类似药就十几个。双靶点以GLP-1R/GIPR和GLP-1R/GCGR两类为主，前者国外已有上市产品，国内多处于1期或临床前阶段。后者国外最快3期，国内多处于1期跟随阶段。GLP-1R/FGF21R国内外进度相当，均处于1期研究阶段。GLP-1R/GIPR/GCGR三靶点国外进展较快，国内跟进者还较少。GLP-1R/GCGR/FGF21R三靶点目前只有道尔处于临床1期研究阶段^[7]。

已上市的药物中对GLP-1RA多肽原料的获取一般用化学合成法或者体外细胞表达。

例如近日已完成III期临床试验的常山药业艾本那肽药物则采用的是化学合成法，艾本那肽是一种长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1RA），是常山凯捷健进行研发注册的1类创新药，用于治疗2型糖尿病。GLP⁃1RA通过激活胰高血糖素样肽-1（GLP⁃1）受体以葡萄糖浓度依赖的方式刺激胰岛素分泌和抑制胰高糖素分泌，同时增加肌肉和脂肪组织葡萄糖摄取，抑制肝脏葡萄糖的生成而发挥降糖作用，并可抑制胃排空，抑制食欲。采用化学合成艾本那肽，以氨基树脂为原料，通过逐一缩合的方式，依次连接带有保护基的氨基酸，后去除树脂和保护基，沉淀离心得到艾本那肽前体或类似物粗肽。粗肽经过C8填料循环纯化来获取精肽。

体外细胞表达通常是与白蛋白或者Fc等融合表达。例如泰康生物的GW002采用白蛋白融合技术，GW004采用GLK融合技术，东方百泰2016年申报CFDA临床的艾塞那肽-Fc。此外还有在经过GLP-1RA-融合蛋白表达后再经过酶切来获取相对纯的GLP-1RA，其中也可以适当加入标签方便后续纯化分离工艺。针对融合蛋白表达的GLP-1RA多肽的纯化和酶切工艺，要经过膜过滤、镍亲和层析、反相纯化等处理，获得高纯度肽-融合蛋白，之后对其进行酶切、纯化，即可获得多肽主链，也有利用通过构建载体、转染等步骤构建工程菌，培养并诱导工程菌融合蛋白包涵体表达，之后通过变性溶解、复性、酶切、亲和流穿和离子交换纯化等步骤，最终获得GLP‑1及其类似物。

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针对不同的技术模式

采用不同的生产纯化方式：

01、表达His标签-融合蛋白-GLP1RA多肽，多肽-融合蛋白在位酶切和纯化的方法，通过镍亲和层析（Ni chromstar FF）方法固定含His标签的多肽-融合蛋白，在镍亲和层析柱上完成多肽-融合蛋白的在位酶切，一步实现含His标签的融合蛋白和多肽主链的分离，流穿液再通过GST亲和层析（Glutathinoe chromstar 4FF）回收肠激酶，反相层析或离子层析（MaXtar Q等）进一步提高纯度，获得多肽主链。

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图3 Ni Chromastar FF纯化His蛋白案例

02、针对Fc融合蛋白表达的GLP-1RA多肽的纯化工艺，可以通过第一步proteinA亲和填料MaXtar ARPA捕获Fc-多肽，后经过离子层析（MaXtar Q/S/DEAE/SP等）或疏水层析（MaXtar Phenyl/Octyl/Butyl等）进行进一步精纯。

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图4 MaXtar ARPA纯化案例

03、针对单纯的GLP-1RA多肽的层析纯化，可以第一步采用阴离子交换层析（MaXtar Q）对GLP-1类似物进行纯化，去除氨基酸缺失杂质，这是反相色谱法难以去除的；第二步层析采用反相色谱法对阴离子纯化物质进行纯化，去除异构体杂质和副反应杂质。

04、非层析纯化，粗肽溶液反相纯化得到精肽，调节pH至3.5-5.5，在-20-25℃析出目标多肽。

05、其他融合蛋白表达的纯化工艺：通常采用脱盐（Puredex G25），离子（MaXtar Q），疏水MaXtar Phenyl/Octyl/Butyl等），蓝胶（MaXtar Blue等）不同组合的方式，去除其中蛋白，氨基酸等杂质达到好的分离效果。例：Puredex G25+MaXtar Q+MaXtar Blue。

纯化工艺可以根据自己的生产特性选择不同层析方式、层析顺序进行调整，也可增加超滤等步骤来减少下游层析纯化压力。

参考文献：

[1]American Diabetes Association. Microvascular complications and foot care: standards of medical care in diabetes-2021[J]. Diabetes Care, 2021, 44(Suppl 1): S111-S167.

[2]中华医学会糖尿病学分会. 中国2型糖尿病防治指南(2020年版)[J]. 中华糖尿病杂志, 2021, 13(4): 315-409.

[3]Hayes MR, Skibicka KP, Grill HJ. Caudal brainstem processing is sufficient for behavioral, sympathetic, and parasympathetic responses driven by peripheral and hindbrain glucagon-likepeptide-1 receptor stimulation. Endocrinology, 2008, 149(8):4059-4068.

[4]Washington MC, Raboin SJ, Thompson W, et al. Exenatide reduces food intake and activates the enteric nervous system of the gastrointestinal tract and the dorsal vagal complex of the hindbrain in the rat by a GLP-1 receptor. Brain Res, 2010(1344):124-133.

[5] Drucker DJ. GLP-1 physiology informs the pharmacotherapy of obesity. Mol Metab, 2022(57):101351.

[6]Tong J, D'Alessio D. Give the receptor a brake: slowing gastric emptying by GLP-1[J]. Diabetes, 2014, 63(2): 407-409.

[7]https://mp.weixin.qq.com/s/sa_6pD0Al2CmFwf3QdQ_Qg.

[8]X. Pi-Sunyer, A. Astrup, K. Fujioka, F. Greenway, A. Halpern, M. Krempf, et al. A randomized, controlled trial of 3.0 mg of liraglutide in weight managementNew England Journal of Medicine, 373 (1) (2015), pp. 11-22

[9]C.W. le Roux, A. Astrup, K. Fujioka, F. Greenway, D.C.W. Lau, L. Van Gaal, et al. 3 years of liraglutide versus placebo for type 2 diabetes risk reduction and weight management in individuals with prediabetes: a randomised, double-blind trial Lancet, 389 (10077) (2017), pp. 1399-1409

[10] M.J. Davies, R. Bergenstal, B. Bode, R.F. Kushner, A. Lewin, T.V. Skjoth, et al. Efficacy of liraglutide for weight loss among patients with type 2 diabetes: the SCALE diabetes randomized clinical trial JAMA, 314 (7) (2015), pp. 687-699

[11]A. Blackman, G.D. Foster, G. Zammit, R. Rosenberg, L. Aronne, T. Wadden, et al. Effect of liraglutide 3.0 mg in individuals with obesity and moderate or severe obstructive sleep apnea: the SCALE Sleep Apnea randomized clinical trial International Journal of Obesity, 40 (8) (2016), pp. 1310-1319

[12]T.A. Wadden, P. Hollander, S. Klein, K. Niswender, V. Woo, P.M. Hale, et al. Weight maintenance and additional weight loss with liraglutide after low-calorie-diet-induced weight loss: the SCALE Maintenance randomized study International Journal of Obesity, 37 (11) (2013), pp. 1443-1451

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