羟基磷灰石HAP的应用及装柱技巧

羟基磷灰石包括两个结合位点：Ca²⁺和PO₄^3-。这些结合位点按照其自有的晶体结构分布。PO₄^3-离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有阳离子交换特性；其中的 Ca^2＋离子与带负电蛋白质的自由羧基簇以金属螯合方式结合。

当蛋白带负电荷时候，可以与 PO₄^3-结合，而与Ca²⁺是相互排斥，这种作用主要是阳离子交换作用。阳离子交换作用会受到缓冲液中的中性盐浓度（如NaCl）。并且随着 pH 的增高阳离子交换作用也会相应减弱。因此，增加磷酸盐的浓度或增高 pH，都会减弱目的蛋白与 PO₄^3-之间的相互作用。

钙金属螯合作用

Ca²⁺可以与蛋白或其他分子（如核酸）表面的羧基簇或磷酸基团发生金属螯合作用，但与 PO₄^3-相排斥。其结合作用是一般离子交换的 15-60 倍。所以受离子的影响比较小，对 NaCl 不敏感。并且随着离子强度会增加钙金属螯合力，原因是离子强度的增加可以屏蔽分子表面功能基团与 PO₄^3-之间的相互排斥作用。这种结合方式可以通过磷酸根进行洗脱。

HAP刚性强但不可压缩，不要把柱头压进填料里，柱头与柱床底部要留出至少0.1-1cm空隙。整个层析过程不能反流和反洗。柱子装好竖直放立，不要倒置和平放。

0.02M PBS,0.15M NaCl,pH7.2–8.0或0.2–0.4M Na₃PO₄/K₃PO₄,pH6.8-10。

注：对于第一次使用的层析介质，装柱缓冲液不能低于 150mM 离子强度，低于该离子强度可能会形成浑浊的悬浮液（如图2）。如果使用高于 150mM 缓冲液，pH 高于 6.8，就会消除或最大减小这种现象。

计算装柱所需层析介质体积Vm：Vm=层析柱横截面积×计划装柱的柱床高度 （注：BARONHAP™ 几乎不溶胀，因此压缩比可以忽略不计）。

制备胶悬液：BARONHAP™ 层析介质为干粉状。称取干粉时，BARONHAP™ type I型，建议按照约0.63g/ml计算；BARONHAP™ type II型，建议按照约0.69g/ml计算。胶悬液比例推荐为30%-50%v/v。

1、用 20% 乙醇为柱底滤膜 ( 筛网 ) 排气。筛网的孔径应≤ 10 μm（填料粒径40μm）。

2、充分排气后，在柱底接口处拧上堵头或关闭柱底阀，并继续注入少量 20% 的乙醇，至覆盖柱上下柱头排气。

3、调整层析柱至垂直。

4、将柱头连接至层析系统上，通过层析系统提供低流速，用 20% 乙醇为柱头滤膜 ( 筛网 )排气。

5、用搅拌棒充分搅匀制备好的层析介质胶悬液，然后一次性缓慢倒入准备好的层析空柱中。注：如果胶悬液体积超过空柱容积，应使用装柱器或用连接头连接另一根空柱管进行延长。

6、将排好气的柱头放入层析柱中，充分贴合胶悬液液面，排除所有气泡。然后拧紧柱头密封圈。

7、拧开柱底阀，启动系统泵，调整流速至300cm/h，使用液流压紧柱床。期间要控制压力不能超过3MPa。如超压，需要降低流。

8、待柱床稳定后 ( 胶面不再下降 )，标记此时胶面位置。停泵，将柱头下压至标记位置以上 1-5mm 即可，注意不要让柱头压在层析介质上，以防柱头压碎介质。

9、重新给予步骤 (7) 中的流速，如胶面不再下降，即完成装柱。若胶面下降，则重复步骤8-9。

半自动柱装填柱效：6915，AS:0.88

手动柱装填柱效：7100，AS:1.83