纯化小技巧 | 99%纯度的秘密：BARONHAP® 羟基磷灰石层析介质纯化技巧大公开

在生物制药领域，如何高效分离复杂的生物分子一直是纯化工作者的难题。羟基磷灰石（HAP）作为一种独特的层析介质，凭借其多模式相互作用机制，成为抗体、疫苗等生物大分子纯化的“秘密武器”。本文将带大家深入了解HAP的纯化原理、产品应用等方面，揭开其“全能”背后的使用技巧。

纯化原理和产品参数介绍

区别于传统介质，HAP填料通过其双位点结构——Ca²⁺和PO₄^3-，融合了阴离子交换、阳离子交换以及金属螯合等分离机制。PO₄^3-位点能够与带正电的蛋白质通过离子键结合，呈现出阳离子交换的特性；而Ca²⁺位点则通过金属螯合或者是阴离子交换方式与带负电的蛋白质自由羧基簇结合。

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图1：结合原理示意图

表1.jpg 表 1. BARONHAP^® 参数表

载量表现

使用CHO细胞来源的IgG1进行载量测试，分子主要结合表现为磷酸基团结合，BARONHAP® Type I型在结合载量上更具优势。

压力流速曲线

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图2：BARONHAP^® Type I 型

压力流速曲线（D:300mm*H:20cm）

应用案例1

BARONHAP® Type I在抗体项目中有效去除聚体

推荐工艺条件

样品信息：双抗阴离子流穿液
层析柱：10*250 mm，20 mL
Buffer A: 20 mM PB, 20 mM Tris，pH 7.2
Buffer A: 20 mM PB, 20 mM Tris，1M NaCl, pH 7.2

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图3:BARONHAP^® Type I层析图谱

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小结：BARONHAP^® Type I在双抗项目表现较好，载量36.9 g/L，纯度从91.8%提高到99.5%，聚集体含量由6%下降至0.5%，收率达到86%。

应用案例2

BARONHAP^® Type II, 40 µm在重组因子类的应用

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图4：BARONHAP^® Type II型洗脱图谱

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图5：进口B公司 II型洗脱图谱

8.20 表.jpg

小结：较进口友商同步对照，性能表现相当。

使用技巧大公开

Q1：

装柱过程的注意事项？

A：

避免使用纯水相，需要有一定离子强度的缓冲液装柱。
柱效测试推荐盐上样测试。

Q2：

HAP可以使用什么缓冲液？

A：

常用的结合缓冲液是用 5 mM 磷酸盐，pH6.8。碱性蛋白可以用 pH 7.2，含 1 M NaCl 磷酸盐缓冲液线性或阶段洗脱。酸性蛋白可以用 500 mM 磷酸盐缓冲液线性或阶段洗脱。至关重要的是，不管结合和洗脱缓冲液 pH 都要高于 pH 6.5.

Q3：

如何延长HAP填料寿命？

A：

在所有缓冲液中，包括贮藏液，建议至少包含 5 mM 磷酸盐，pH 都要等于或高于 6.5。对于所有应用尽量选用高 pH 缓冲液。添加 ppm 级别的钙离子可以提高填料的坚固度。
当第一次使用 NaCl 洗脱时，由于氢离子的脱落，将会引起 pH 降低，因此添加 co-buffer，如 MES,将大大提高填料坚固度。
用 NaOH 保存柱子阻止碳酸盐沉淀在柱子表面。
避免突然地改变流速减少压力冲击，压力冲击将破坏柱床。
碱洗后建议增加高盐的冲洗，充分熟化。

Q4：

HAP使用寿命和保存效期？

A：

如果正确的装填，同时维持 pH 高于 6.5， HAP 至少可以使用 40 个循环。如果小心的避免填料被破坏，HAP可以反复装填 20 次或更多。密闭存储，4-30℃，可以保持 5 年。

Q5：

HAP目前有多大层析柱的放大经验？当前单批次最大产能？

A：

最大450 mm，装柱柱高20 cm左右。50 kg。

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