高通量平台工艺开发与筛选策略

随着生物制药行业的快速发展，高效、稳定的纯化工艺开发变得日益重要。高通量纯化技术通过并行实验与自动化手段，实现了对层析填料、缓冲液条件及工艺参数的大规模快速筛选与优化，显著提高了工艺开发的效率与可靠性。本文将系统介绍高通量纯化平台的核心目标、筛选策略，并结合实际案例说明其应用流程。

高通量纯化工艺平台开发的核心目标

高通量筛选策略

填料筛选

亲和层析筛选策略

目标产物特性分析：对目标产物的结构以及亲和力位点进行充分评估，如重组蛋白的标签类型、治疗性抗体的结构等。
填料初选：依据目标产物特性选择亲和填料类型，如含镍离子的亲和填料用于捕获含组氨酸标签的重组蛋白，protein A或protein G亲和填料用于捕获含有完整抗体结构的抗体。
初步筛选：选择3-4款该类型亲和填料进行筛选，采用平台化的层析方法，如抗体亲和层析通常选用100 mM的乙酸钠-乙酸/100 mM甘氨酸的缓冲液的洗脱目标产物，对目标产物的收率以及纯度进行检测。
工艺优化：依据初步筛选结果进一步进行填料优化，结合相应的DOE实验设计，对上样、淋洗、洗脱等工艺参数进行优化。

离子交换层析筛选策略

确定层析目的与目标产物等电点：明确层析目的以及目标产物的等电点，目标产物的等电点可以通过目标产物序列计算获得，也可以通过毛细管等电聚焦电泳来获得。
填料与模式选择：对于等电点低于目标产物等电点的杂质，可选用阴离子层析-流穿模式进行纯化；对于等电点高于目标产物等电点的杂质，通常可采用阳离子-结合洗脱的层析模式进行纯化。
筛选方法：流穿模式的填料筛选通常可运用DOE结合96孔板的方式进行高通量筛选；结合洗脱模式的填料筛选首选柱层析筛选的方式。

疏水层析筛选策略

疏水性预实验：通过高盐梯度预实验确定目标分子疏水性，结合梯度洗脱优化疏水配基密度，可对目标产物的疏水性有一个预判。
上样盐浓度优化：目标产物会在高盐体系下与疏水性填料进行结合，在低盐条件下进行洗脱，因此需要优化层析过程上样时的盐浓度，通常选用硫酸铵作为上样预处理的盐。
填料筛选：初步确定配基种类和上样所需的盐浓度后，可以采用从高盐到低盐梯度洗脱的方式进行填料筛选和工艺优化，后续可以通过实验设计进一步优化为步级洗脱。

凝胶过滤层析筛选策略

分子量评估：首先要对目标产物以及杂质的分子量有个大致了解，可通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法获得。
填料选择：主要关注填料的孔隙直径范围，通常来说孔隙直径越大分离的范围也就越大，如Geldex^® 75pg的孔隙较小，填料分离范围在3-70 kda，而Geldex^® 200pg的孔隙较大，填料分离范围在10-600 kda，因此首先需要根据纯化需求选择合适的填料。
特异性吸附：关注填料对目标产物的特异性吸附作用，应尽可能减少目标产物与填料的特异性吸附。

缓冲液筛选

缓冲液类型选择

根据目标蛋白的性质和纯化需求，选择合适的缓冲液类型，如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸盐缓冲液等。

参数梯度设计

对缓冲液的pH值、离子强度、盐浓度等参数进行梯度设置，如pH值可设置为5.5、6.0、6.5、7.0，7.5等，离子强度可设置为0.1 M、0.2 M、0.3 M等。

高通量筛选实验

将不同参数的缓冲液分别用于填料的平衡、上样、冲洗和洗脱等步骤，通过检测蛋白的纯度、回收率、杂质去除率等指标，筛选出最佳的缓冲液条件。

工艺参数筛选

确定关键参数

如上样量、流速、洗脱梯度等，这些参数对纯化效果和工艺稳定性有重要影响。

实验方案设计

采用正交实验法、单因素实验法等DOE方法，对关键工艺参数进行组合设计，确定实验条件。