Search
×
E-mail

炙手可热的双抗赛道,如何实现高效纯化?


双特异性抗体是一种能够同时结合两种不同抗原的抗体分子,跟单抗或混合使用两个单抗相比,双抗因为其独特的生物学机制,在抗肿瘤的临床研究和临床治疗中显示出特异性更高、靶向性更强的显著优势。然而,双抗复杂的表达体系和结构多样性也为其工艺实现带来了巨大挑战,尤其是其下游杂质的去除方法。本文将详细阐述双抗的结构特点及相应杂质,并针对双抗下游纯化工艺的难点给出百林科的解决方案。


2022年是全球双抗步入收获期的一年,4款双抗在全球范围内获批,数量超越了此前总和。随着单抗各靶点不断进入红海竞争状态,国内药企更是已经意识到双抗药物的广阔发展空间,研发热情空前高涨。包括康方生物、百济神州、信达生物、君实生物、宜明昂科、康宁杰瑞等创新药企均在该领域发力。其中,康方生物的首款国产双抗药物卡度尼利单抗一鸣惊人,以亮眼的业绩为业内的双抗研发信心注入了一剂强心针。双抗当下俨然成为了生物医药界最炙手可热的赛道。


由于其独特的生物学机制,双抗相比单抗在治疗效果上具有明显优势。但于此同时双抗也存在诸多缺点,主要包括:

1、链错配 (主要包括重链之间错配引起的同源抗体;轻链之间错配引起的异源抗体)

2、Fc片段引发的问题(Fc片段的存留与双抗药物的渗透性、半衰期、稳定性、免疫原性等密切相关)

3、功能性、亲和力、效价等(主要为非IgG-like问题)


此外,双抗结构可以被近一步分为双价双抗( bivalent, 1+1),三价双抗(trivalent, 1+2 或者2+1)和四价双抗(tetravalent, 2+2)。虽然抗原配对价位的增加可以有效地提高双抗的特异性和靶向性,但同时也给下游工艺开发带来了前所未有的挑战。双抗纯化的主要难点包括 1)杂质组成极为复杂, 除了常见的宿主细胞蛋白(host cell protein)和宿主细胞基因 (host cell DNA),双抗杂质还包括各式各样错配产物,抗体片段和聚合物;2)配错产物在结构上和物化特性上跟双抗产物非常接近,极难去除;3)杂质量大,错配产物最高可以达到总蛋白表达量的90%以上;4)比单抗相比,双抗更容易发生聚合,尤其是抗体片段双抗。


除了以上问题外,双抗分为非对称双抗和对称性双抗,而根据是否含有Fc片段,非对称双抗又可以分为IgG-like和非IgG-like。对称性双抗C端加另一抗体的可变区。由于链延长,最大的问题,聚集体含量会很高。根据目前发表的文献,高达50%,而在二硫键设计,聚集体含量可降至20%;此外,非对称性双抗在表达过程中会产生多种副产物,主要分为同源二聚体,半抗,多聚体三类。根据不同的副产物纯化工艺的选择有所不同。


640 (1).png


图1:双抗纯化流程图


针对同源抗体和半抗可利用Protien A 层析分担后续纯化去出同源抗体和半抗的压力。一般而言,同源二聚体很难去除,因为其物理化学性质都与目的双抗相似。因此在分子设计上可以通过一些方法区分同源二聚体,如通过亲和力差异性与电荷及疏水性差异来进行纯化。例如通过阻断重链恒定区protein A结合位点的分子设计策略可以有效简化同源二聚体的去除。


640.png


640 (2).png

图2:可通过PH梯度洗脱达到同源二聚体的去除



产品的相关杂质并不依赖这一步,捕获阶段主要对于工艺杂质HCP、DNA的去除,或保证产品比较高的回收率。但针对双抗副产物比较多的这个情况,我们也是希望让Protein A承担一些的责任,减轻下游去除这些副产物的压力。


640 (3).png

图3:通过条件优化,达到去除半抗的效果



百林科MaXtar ARPA的配基是修饰的耐碱rProtien A,可耐受0.5M NaOH进行CIP,具有高流速,高载量的特性,动态载量>60mg/ml。


640.jpg


640 (4).png

图4:0.5 M NaOH 分别处理0h、12h、24h、48 h处理后MaXtar ARPA动态结合载量均能够维持40 mg/ml以上,且仍可以保持80%以上的初始载量水平。


640 (5).png

图5:MaXtar ARPA运行200个cycle以后,DBC>90%

图片


层析柱:4.7ml(柱高10cm)

样品:人血来源的IgG,6mg/ml

保留时间:上样阶段6min,其余4min

CIP:0.5M NaOH,15min

测试次数:220次


640 (6).png

图6:MaXtar ARPA动态结合载量RSD小于5%



MaXtar ARPA

在双抗项目中的表现


640 (1).jpg


640 (2).jpg

图7: 在收率相当的情况下SEC-HPLC结果显示, MaXtar ARPA与某进口品牌无明显差异


此外,羟基磷灰石CHT在双抗纯化中对与半抗和多聚体的去除拥有良好的表现,对于聚集体不能控制在较低水平的情况,使用BaronCHT type Ⅱ开发可以起到很好的效果,百林科提供高质量的Ⅰ和Ⅱ型羟基磷灰石。640 (3).jpg

图8:百林科羟基磷灰石球体形貌和晶体结构



参考文献

  Bent W., et al., Development of a single-step, protein A chromatography process for bispecific antibodies in early screening. Summlt.

  Source:Y.Li., A brief introduction of IgG-like bispecific antibody purification: Methods for removing product-related impurities, Protein Expression and Purification (2019)

  Yifeng Li, Ying Wang, Peter (Keqiang) Shen, Weichang Zhou ,A roadmap for IgG-like bispecific antibody purification

  Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies



点击这里查看百林科层析填料




即刻咨询

想了解百林科验证检测服务更多详情?填写右侧表单,即刻与我们取得联系
地址
上海市浦东新区盛夏路58号15栋
联系我们
邮箱:
info@biolink.com
电话:
400-058-9000
地址:
上海市浦东新区盛夏路58号15栋